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- Diversidade nutricional de acessos de tomate de mesa das regiões Centro e Norte de PortugalPublication . Pereira, Alexis; Añibarro-Ortega, Mikel; Rocha, Filomena; Lopes, V. Rolim; Carvalho, Ana Maria; Barata, Ana Maria; Barros, Lillian; Pinela, JoséO tomate (Solanum lycopersicum L.) é uma das culturas hortícolas mais importantes em todo o mundo e desempenha um papel fundamental na dieta mediterrânica. Ao longo dos anos, o cultivo de tomate em sistemas agrícolas extensivos, como hortas e quintais, levou ao surgimento de várias variedades tradicionais com características morfológicas e sensoriais distintas. Estas variedades representam um valioso reservatório de diversidade genética que deve ser preservado. No entanto, há uma escassez de dados na literatura que relacionem as características morfológicas do tomate com diferenças na sua composição. O objetivo deste estudo foi caraterizar a diversidade nutricional de acessos de tomate de mesa originários das regiões Centro e Norte de Portugal, atualmente conservados no Banco Português de Germoplasma Vegetal. Para isso, foram selecionados vários acessos de tomate conhecidos localmente como "comum," "coração-de-boi," "pequenino," "rasteiro" e "miúdo". Estes acessos foram regenerados em campos experimentais, sob as mesmas condições edafoclimáticas, para obter frutos maduros para análise e reposição de sementes. Os frutos foram analisados quanto à sua composição centesimal, incluindo os teores de humidade, proteína, gordura, cinzas e hidratos de carbono, utilizando métodos analíticos oficiais para alimentos. Os perfis individuais de açúcares livres, ácidos orgânicos, ácidos gordos e tocoferóis foram caraterizados por meio de diferentes técnicas cromatográficas. Os carotenoides licopeno e β-caroteno foram quantificados utilizando um método espetrofotométrico. Os resultados destas análises contribuíram para uma compreensão abrangente sobre as características nutricionais dos acessos de tomate de mesa selecionados e com origem nas regiões Centro e Norte de Portugal
- Enhancing Tomato Growth and Quality Under Deficit Irrigation with Silicon ApplicationPublication . Añibarro-Ortega, Mikel; Pereira, Alexis; Pinela, José; Liava, Vasiliki; Chaski, Christina; Alexopoulos, Alexios A.; Barros, Lillian; Petropoulos, Spyridon A.This study aimed to evaluate the effect of two irrigation systems (deficit irrigation (DI)—70% of field capacity—and full irrigation (FI)—100% of field capacity) and a biostimulant formulation (silicon (Si) and calcium (Ca) at four different rates) on the chemical composition and fruit quality of greenhouse-grown tomatoes. Deficit irrigation and biostimulant application influenced the proximate composition of tomato fruits. Fructose and glucose were the main soluble sugars, while malic and citric acids were the predominant organic acids. Free sugar and organic acid content increased under DI and biostimulant applications. In contrast, deficit irrigation combined with biostimulant application decreased α-tocopherol levels. In terms of carotenoids, lycopene and β-carotene concentrations were higher under full irrigation. The main fatty acids were palmitic (C16:0) and linoleic (C18:2n6) acids, with saturated (SFA) and polyunsaturated (PUFA) fatty acids being the main classes. Moreover, biostimulant applications reduced the total phenolic content regardless of the irrigation regime, whereas the flavonoid content increased when biostimulants were applied under FI conditions. Regarding antioxidant activity (assessed by TBARS and OxHLIA assays), a variable response to irrigation and biostimulant application was observed. In conclusion, the application of Si and Ca under DI showed promising results in terms of yield and quality of tomato fruit and it could be considered a sustainable strategy to mitigate adverse effects of climate change on horticultural crops.
- Valorização de casca de marmelo como fonte de fibra e compostos bioativos: otimização da extração e avaliação de bioatividadesPublication . Pereira, Alexis; Pinela, José; Barros, Lillian; Nogueira, António José M.O marmelo é o fruto de Cydonia oblonga Mill., um membro da família da maçã e da pera (Rosaceae). Este não é apreciado cru devido à sua dureza, amargura e adstringência, mas é amplamente processado noutros produtos alimentares, como a marmelada, sendo a casca ou epicarpo descartado sem valor comercial. Como tal, este trabalho surgiu com o objetivo de avaliar o potencial deste subproduto ser integrado na cadeia de valor alimentar sob a forma de ingredientes alimentares ricos em compostos bioativos e fibra alimentar. Para alcançar este objetivo, foi implementado um desenho de composto central rotativo (DCCR) acoplado à metodologia de superfície de resposta (RSM), combinando as variáveis independentes tempo (1–119 min), temperatura (25–94 °C) e proporção de etanol (0–100%) numa matriz de 20 execuções. Após processamento da amostra, os sobrenadantes das extrações foram denominados de extratos bioativos (EB) e os resíduos sólidos de extratos concentrados em fibra (ECF), sendo a casca de marmelo totalmente aproveitada. Os rendimentos de extração foram determinados por gravimetria e, enquanto os EB foram caracterizados quanto à sua composição em compostos fenólicos, ácidos orgânicos e açúcares livres usando diferentes técnicas de cromatografia líquida, os ECF foram analisados quanto à sua cor e teores de fibra alimentar usando um colorímetro e um método enzimático-gravimétrico, respetivamente. Os resultados experimentais foram usados como variáveis dependentes (ou de resposta) e ajustados a uma equação polinomial quadrática para obtenção de modelos teóricos, os quais foram validados com base em diferentes critérios estatísticos (e.g., R2, R2Adj e falta de ajuste). Estes traduziram as tendências de extração e permitiram determinar as condições ótimas de extração. Os rendimentos de extração de EB e ECF contrabalançaram e variaram de 34,47 a 67,09% (m/m) e de 39,82 a 65,52% (m/m), respetivamente. No EB foi possível identificar 17 compostos fenólicos, incluindo 6 ácidos fenólicos, 9 flavan-3-óis e 2 flavonóis glicosilados, os ácidos oxálico, quínico e málico e os açúcares frutose, glucose e sacarose. O teor total de compostos fenólicos variou de 6,5 a 10,13 mg/g EB. No ponto central do desenho, os flavan-3-óis e os ácidos fenólicos representaram 40,3% e 34,6% da fração fenólica, respetivamente, e os flavonóis corresponderam a 25,1%. Entre os ácidos orgânicos detetados, o ácido málico foi o mais abundante (representando mais 95% do total de ácidos orgânicos), com teores chegando a 6,97 g/100 g EB. Assim, a casca de marmelo surgiu como uma fonte alternativa deste composto utilizado no setor alimentar e farmacêutico. Quanto aos açúcares, a frutose foi o mais abundante (60-79%), seguido pela glucose (11-25%). Estes dois açúcares redutores juntamente com a sacarose representaram 44 a 62,8% dos EB obtidos e, como esperado, os teores mais baixos estiveram associados ao uso de maiores proporções de etanol. Os modelos preditivos permitiram determinar as condições ótimas de processamento para o rendimento de EB (66,4 min, 28,4 ºC e 42,6% de etanol), compostos fenólicos (64,2 min, 88 ºC e 0% etanol) e ácido málico (87,7 min, 92,7 ºC e 54,4% etanol) que permitiram alcançar valores de respostas de 69 ± 2% (m/m), 10,6 ± 0,2 mg/g EB e 7,9 ± 0,3 g/100 g EB, respetivamente. Para os ECF, as maiores proporções de etanol estiveram associadas a maiores rendimentos, mas a menores teores de fibra alimentar (a qual representou 52,5-65,6% dos ECF), o que provavelmente se deveu à maior extração de açúcares solúveis. Além disso, quanto maior a percentagem de açúcares, mais claros (valores de L* mais elevados) foram os ECF. Pelo contrário, os ECF com maior proporção de fibra foram mais escuros, o que também poderá ter resultado do processamento a alta temperatura com 20–50% de etanol. A obtenção de ECF foi promovida por 69,1 min de extração a 61,3 ºC, usando 99,9% de etanol. Já o teor máximo de fibra alimentar (67 ± 1 g/100 g ECF) esteve associado ao processamento a 92,2 ºC com 35,5% de etanol, enquanto o tempo não foi significativo para o intervalo estudado. As condições associadas a máximos de extração de compostos fenólicos e ácido málico foram seguidamente usadas para obtenção de extratos enriquecidos nestes compostos bioativos, o que permitiu validar experimentalmente os modelos preditivos com uma boa concordância entre dados teóricos e experimentais. Depois disso, o potencial conservante destes extratos foi avaliado pela medição da sua atividade antioxidante via inibição da peroxidação lipídica e da hemólise oxidativa e potencial antimicrobiano contra bactérias e fungos associados a contaminações alimentares. Os extratos destacaram-se em vários aspetos comparativamente a aditivos alimentares usados como controlo positivo, principalmente os enriquecidos em ácido málico. Este trabalho mostrou que é possível valorizar a casca de marmelo em ingredientes alimentares bioativos e funcionais, seguindo uma estratégia de “desperdício zero”.
- Obtenção otimizada de extratos bioativos de casca de marmelo: uma fonte alternativa de conservantes naturaisPublication . Pereira, Alexis; Añibarro-Ortega, Mikel; Cirić, Ana; Soković, Marina; Nogueira, António José M.; Pinela, José; Barros, LillianO marmelo (Cydonia oblonga M.) é um fruto amargo e adstringente utilizado sobretudo na produção de marmelada e outros produtos alimentares açucarados. De acordo com a Legislação Portuguesa [1], a marmelada é uma mistura homogénea e consistente obtida exclusivamente da cozedura do mesocarpo do marmelo com açúcares. Portanto, a produção industrial de marmelada implica o descarte da casca como um subproduto. No entanto, estudos anteriores indicam que a casca deste fruto possui compostos bioativos com propriedades antioxidantes e antimicrobianas e efeitos promotores de saúde [2-4]. Este estudo propõe assim a reinserção deste subproduto na cadeia de valor sob a forma de um conservante alimentar natural. Para otimização do processo de extração de compostos bioativos a partir desta matriz vegetal, foi implementado um desenho de composto central circunscrito de 20 pontos, combinando os efeitos dos fatores tempo (1–119 min), temperatura (25–94 °C) e proporção de etanol (0–100%). Como variáveis dependentes, foram considerados o rendimento das extrações, avaliado gravimetricamente, e os teores de compostos fenólicos e ácidos orgânicos, quantificados por HPLC-DAD-ESI/MSn e UFLC-PDA, respetivamente [5]. Estas análises permitiram identificar vários compostos fenólicos, incluindo ácidos fenólicos, flavan-3-óis e flavonóis, e ácido málico, entre outras moléculas. Os dados quantitativos foram seguidamente ajustados a uma equação polinomial quadrática para obtenção de modelos teóricos, os quais foram validados estatisticamente e usados para determinar as condições ótimas de extração. Estas foram aplicadas experimentalmente e os extratos obtidos foram analisados quanto ao potencial conservante, através da avaliação da atividade antioxidante por ensaios in vitro e da atividade antimicrobiana por métodos de microdiluição [5]. Estes extratos apresentaram capacidade de inibir a peroxidação lipídica e de inibir o crescimento de fungos e bactérias associadas a contaminações alimentares, destacando-se em alguns aspetos comparativamente com aditivos alimentares usados como controlo positivo. Estes resultados destacam o potencial inexplorado da casca de marmelo para obtenção de extratos bioativos ricos em compostos fenólicos e ácido málico, os quais poderão ser usados pela indústria alimentar para incorporação em alimentos e bebidas.
- Upcycling quince peel into bioactive ingredients and fiber concentrates through multicomponent extraction processesPublication . Pereira, Alexis; Añibarro-Ortega, Mikel; Kostić, Marina; Nogueira, António José M.; Soković, Marina; Pinela, José; Barros, LillianThis study aimed to promote the total upcycling of quince (Cydonia oblonga Mill.) peel into bioactive extracts (BEs) and fiber concentrates (FCs). The multicomponent extraction processes were optimized using response surface methodology (RSM) coupled with a 20-run experimental design, where the effects of time (1-120 min), temperature (25-95 degrees C), and EtOH percentage (0-100%) were combined. In addition to the extraction yields, BEs were analyzed for phenolic compounds, organic acids, and other water-soluble constituents, while FCs were characterized for their color and dietary fiber content. Statistically valid theoretical models were obtained by fitting these dependent variables to a quadratic equation and used to predict optimal extraction conditions. Those obtained for phenolic compounds and malic acid were experimentally validated, yielding 9.3 mg/g and 7.6 g/100 g of these bioactive constituents, respectively, and about 51% (w/w) FC. These BEs showed in vitro antioxidant activity and antimicrobial effects against foodborne fungi and bacteria, standing out in some aspects in relation to synthetic food additives, mainly the malic acid-enriched BE. Overall, the developed extraction processes allowed valorizing of quince peel in FCs and BEs that could be used as natural fortifiers or preservatives in the formulation of foods, beverages and dietary supplements.
- Natural food ingredients from quince peel: towards a "zero-waste" production systemPublication . Pereira, Alexis; Añibarro-Ortega, Mikel; Rodrigues, Matilde; Nogueira, António José M.; Pinela, José; Barros, LillianQuince is the yellow fruit of the deciduous tree Cydonia oblonga Mill. Its taste is sour and astringent when eaten raw, so it is usually processed into marmalade and many other food products, mostly sweets, through processes that discard the peel as a by-product. Therefore, this work was carried out to promote the upcycling of quince peel into valuable food ingredients following a "zero waste" approach. A response surface methodology (RSM)-coupled experimental design with 20 runs, combining five levels of time (1–120 min), temperature (25–95 °C) and ethanol concentration (0–100%), was implemented for maximizing the extraction of soluble solids and malic acid while simultaneously obtaining fiber concentrate extracts. The yields of soluble solids and fiber concentrate extracts were determined gravimetrically. Malic acid, which has been used as a food preservative, was analyzed by ultra-fast liquid chromatography with photodiode array detection.1 The dietary fiber content of the fiber concentrate extracts was determined by an enzymatic-gravimetric method (AOAC Official Method 985.29) and their color was measured with a portable colorimeter.2,3 The three independent variables affected significantly the extraction process and the predictive model equations were validated based on different statistical criteria, which allowed to determine the optimal extraction conditions. In general, the soluble solids yield was promoted by lower temperatures and ethanol concentrations, while malic acid was better extracted at higher temperatures for longer processing times. In turn, the fiber concentrate extracts remaining after extraction had opposite yields to the soluble solids. However, the highest yields of these fiber concentrates were not in agreement with their dietary fiber contents. The highest fiber values were recorded in the concentrate extracts obtained at high temperatures and medium-low ethanol concentrations. In fact, only these two independent variables significantly impacted its extraction, through linear, quadratic, and also interactive effects. Furthermore, the lighter fiber concentrate extracts were those with the highest yields. Overall, quince peel can be totally upcycled into natural food ingredients rich in malic acid and dietary fiber.
- Efeito do método de extração no perfil fenólico e na atividade antioxidante de extratos de casca de marmeloPublication . Pereira, Alexis; Othman, Souha; Añibarro-Ortega, Mikel; Dias, Maria Inês; Pinela, José; Barros, LillianO marmelo é o fruto de uma pequena árvore decídua (Cydonia oblonga Mill.) nativa do Cáucaso e cultivada em vários países, incluindo Portugal. Devido ao seu sabor amargo e adstringente, o marmelo é geralmente processado em produtos alimentares açucarados, tais como a marmelada, um doce típico português. Durante a confeção deste alimento, a casca deste fruto é frequentemente descartada como subproduto. Apesar disso, estudos anteriores apontaram que a casca do marmelo possui compostos bioativos com efeitos promotores de saúde, bem como propriedades bioativas [1]. Assim, este trabalho teve como objetivo comparar o perfil fenólico e a atividade antioxidante in vitro de extratos de casca de marmelo obtidos por maceração dinâmica hidroetanólica (1 h + 1 h de extração) e decocção (5 min de fervura + 5 min de repouso). Para isso, o rendimento de extração foi avaliado gravimetricamente e os compostos fenólicos detetados nos extratos foram caracterizados por HPLC-DAD-ESI/MSn [2]; a atividade antioxidante in vitro foi avaliada através do ensaio de inibição da formação de substâncias reativas aos ácido tiobarbitúrico (TBARS) e da hemólise oxidativa [2]. A análise cromatográfica permitiu identificar três classes de compostos fenólicos, nomeadamente ácidos fenólicos, flavonóis e flavan-3-óis. O conteúdo de compostos fenólicos foi de 4,70 mg/g no extrato hidroetanólico e de 4,27 mg/g no extrato aquoso. O extrato hidroetanólico foi mais eficaz em inibir a peroxidação lipídica e a hemólise oxidativa do que o extrato preparado por decocção, o que concordou com os maiores teores de flavan-3-óis. Embora os métodos de extração testados tenham empregue diferentes solventes, tempos de processamento e temperaturas, a maceração dinâmica hidroetanólica foi mais adequada para obter extratos com maiores teores de polifenóis e maior atividade antioxidante. Assim, os resultados evidenciaram que o método de extração afeta a extração de compostos fenólicos e, consequentemente, a atividade antioxidante. Desta forma, a casca do marmelo poderá ser reinserida na cadeia de valor através da sua reutilização em ingredientes naturais antioxidantes para alimentos e bebidas.
- Novel antioxidant and fibre-rich food ingredients from quince peelPublication . Pereira, Alexis; Othman, Souha; Dias, Maria Inês; Añibarro-Ortega, Mikel; Ferreira, Isabel C.F.R.; Pinela, José; Barros, LillianQuince (Cydonia oblonga Mill.) is a sour and astringent fruit usually processed into various food products, such as jam, jelly, and quince pudding, or marmalade. Although the peel is often discarded as a by-product during the processing steps, it has been reported as a valuable source of bioactive phytoconstituents [1-3]. Therefore, this work was carried out to characterize the quince peel composition in phenolic compounds and dietary fiber, and to evaluate its antioxidant activity. The dry peel powder was subjected to extractions by hydroethanolic maceration (HM) and hot water (HW). The obtained extracts were characterized for their phenolic composition by HPLC-DAD-ESI/MSn [4] and their antioxidant activity was evaluated in vitro by their ability to inhibit the oxidative hemolysis and the formation of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) using sheep erythrocytes and porcine brain cells, respectively [4]. The fiber content in the solid residues from the extractions was determined by an enzymatic-gravimetric method [5]. The analysis allowed to identify of 16 phenolic compounds, including caffeoylquinic acids, flavan-3-ols, and flavonol glycosides. Flavan-3-ols accounted for about 57% and 48% of the total phenolic fraction of the HM and HW extracts, respectively. The HM extract showed greater antioxidant activity than the HW extract in both in vitro assays, a result that strongly correlated with the higher content of flavan-3-ols. In turn, both extraction residues revealed fiber contents that reached nearly 37 g/100 g. Overall, this study demonstrated that it is possible to obtain antioxidant phenolic extracts and novel fiber-rich ingredients from quince peel, which could be used in food and beverage formulation. Future work is planned to optimize the extraction processes and assess their effectiveness as natural food preservatives and fortifiers.
- Solanaceae crop by-products as renewable sources of bioactive phenolic extractsPublication . Añibarro-Ortega, Mikel; Petrović, Jovana; Dias, Maria Inês; Pereira, Alexis; Soković, Marina; Ferreira, Isabel C.F.R.; Prieto Lage, Miguel A.; Simal-Gandara, Jesus; Pinela, José; Barros, LillianThe upcycling of agri-food by-products into high added-value products has been promoted in recent years. Solanaceae is one of the main plant families supplying important vegetable and staple food crops worldwide. Bell pepper (Capsicum annuum L.) and eggplant (Solanum melongena L.) are two good examples, and their agricultural production generates million tons of valueless crop remains (especially plant aerial parts) [1], whose insertion in the value chain needs to be promoted and investigated to ensure the efficient use and circularity of these natural resources. Moreover, while the fruits of these species are well characterized for their nutritional value [2], the residual biomass of these crops remain unexplored, and little is known about their composition in bioactive constituents. Therefore, this work aimed at characterizing the phenolic compounds of bell pepper and eggplant crop by-products and evaluating the bioactive activities in order to find possible industrial applications. The phenolic profiles of both plant materials were characterized in the hydroethanolic extracts by the HPLC-DAD/ESI-MSn technique [3]. The extracts were also used to evaluate in vitro antioxidant activity, with regard to their ability to inhibit lipid peroxidation and oxidative haemolysis [4], and antimicrobial effects against foodborne microorganisms, by serial microdilution methods [3]. The bell pepper by-product extract showed a qualitative predominance of flavonoids and a better performance in the lipid peroxidation and oxidative haemolysis inhibition assays, as well as greater antifungal activity. In turn, phenolic acids stood out as main compounds in the eggplant by-product extract, with presented higher activity against the tested bacterial strains. Overall, the obtained extracts seemed to be a promising material for application in the food and nutraceutical industries, among other sectors, given their high potential to be used as natural preservative ingredients
- Vigilância epidemiológica de resistência do acinetobacter baumannii a três grupos de antibióticos na europaPublication . Teixeira, Cristina; Pereira, Alexis; Ribeiro, Beatriz; Cerqueira, Regina; Cruz, Vitor; Alves, Maria JoséVigilância epidemiológica de resistência do Acinetobacter Baumannii a três grupos de antibióticos na Europa Introdução: Acinetobacter baumannii é um agente patogénico ubiquitário capaz de causar Infeções Associadas aos Cuidados de Saúde (IACS). Um dos fatores que mais contribui para a multirresistência bacteriana é o uso contínuo e indiscriminado de antibióticos. Objetivos: Avaliar a prevalência de isolados resistentes de A. baumannii a carbapenémicos, fluoroquinolonas e aminoglicosídeos, observados entre 2012 e 2017 em regiões da Europa. Materiais e Métodos: Recolha de informação da base de dados da European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC), reportada entre 2012 e 2017 em países Europeus. Foram calculadas as prevalências de resistência e respetivos intervalos de confiança a 95% do A. baumannii para cada grupo de antibióticos em quatro grandes regiões Europeias (Norte, Leste, Oeste e Sul), através do método de Wald e recorrendo ao software WinPepi. Resultados e Discussão: A região sul (onde se incluiu Portugal) apresenta valores mais elevados de prevalência de resistência, sendo de 75,44% (IC95%: 74,7%; 76,2%) para aminoglicosídeos, 85,2% (IC95%: 84,5%; 85,8%) para carbapenémicos, 84,7% (IC95%: 84,0%; 85,3%) para fluoroquinolonas e 73,7% (IC95%: 72,9%; 74,5%) para a combinação dos três tipos de antibióticos. Em contraste, a região oeste apresenta valores mais baixos de prevalência de resistência variando entre 5,8% (IC95%:5,1%; 6,5%) para carbapenémicos e 10,4% (IC95%:9,6%; 11,2%) para fluoroquinolonas, sendo que apenas 3,8% (IC95%: 3,2%; 4,3%) dos isolados apresentaram resistência à combinação de antibióticos. Na região norte os valores de prevalência de resistência variaram entre 13,9% (IC95%: 12,8%; 15,0%) para carbapenémicos e 18,6% (IC95%: 17,4%; 19,7%) para fluoroquinolonas, com 11,1% (IC95%: 10,1%; 12,1%) de isolados resistentes à combinação de antibióticos. A região leste apresenta valores de prevalência de resistência entre 53,2% (IC95%: 49,9%; 52,4%) para carbapenémicos e 71,4% (IC95%:70,4%; 72,5%) para fluoroquinolonas, apresentando 48,1% (IC95%: 46,8%; 51,2%) de resistentes à combinação de antibióticos. Conclusão: Contrariamente aos países da região norte e oeste, os países da região sul demonstraram uma elevada percentagem de resistência do A. baumannii aos carbapenémicos, aminoglicosídeos e fluoroquinolonas. Estas diferenças realçam a necessidade de se perceber os fatores que podem modificar o elevado risco de resistência aos antibióticos. Referências [1] Fournier PE, Richet H, Weinstein RA. The Epidemiology and Control of Acinetobacter baumannii in Health Care Facilities. Clin Infect Dis [Internet]. 2006; 42(5):692–9. Available from: https://academic.oup.com/cid/article-lookup/doi/10.1086/500202. [2] Rao GG, Ly NS, Diep J, Forrest A, Bulitta JB, Holden PN, et al. Combinatorial pharmacodynamics of polymyxin B and tigecycline against heteroresistant Acinetobacter baumannii. Int J Antimicrob Agents [Internet]. 2016; 48(3):331–6. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2016.06.006. [3] Rönnerstrand B, Lapuente V. Corruption and use of antibiotics in regions of Europe. Health Policy (New York) [Internet]. 2017; 121(3):250–6. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.healthpol.2016.12.010.