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Publicação
Development of a Molecular Tool to Detect Mutations Associated with Varroa destructor Resistance to Pyrethroids
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Resumo(s)
The Western honey bee (Apis mellifera) is essential for agriculture and biodiversity, yet colonies are increasingly threatened by Varroa destructor, a parasitic mite that weakens hosts and vectors viruses such as Deformed Wing Virus (DWV). Control still relies heavily on acaricides, pyrethroids (fluvalinate, flumethrin), organophosphates (coumaphos) and formamidines (amitraz), but prolonged use has driven resistance. In V. destructor, pyrethroid resistance is strongly associated with mutations in the voltage-gated sodium channel (VGSC), particularly the M918L and L925V substitutions, which have been reported across Europe and motivate targeted surveillance in Portugal.
This study aimed to develop a rapid LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) assay to detect VGSC resistance-associated mutations. A Portuguese baseline was first established by sequencing the VGSC Domain II fragment from 100 mites collected across 35 apiaries. Sanger genotyping showed that 38% of successfully analyzed mites carried the M918L/L925V resistant haplotype, 54% were wild type, and 8% remained unresolved after repeat testing, indicating marked geographic heterogeneity. Guided by curated alignments, two LAMP primer sets targeting the resistance region were designed (NEB LAMP Designer; LAMP DESIGNER v1.16), screened in silico for structural/thermodynamic suitability, and experimentally optimized using real-time fluorescence, with electrophoretic confirmation.
Initial optimization on a CFX96 platform (63–67 °C) yielded amplification in both samples and no-template controls, with characteristic ladder-like products in NTCs, consistente with template-independent amplification driven by primer–primer and/or intra-primer interactions. Under more stringent conditions on QuantStudio™ 5 (68–70 °C), one primer set (NEB Set ID 36) achieved partial genotype discrimination at 69 °C, with earlier amplification in resistant than in wild-type samples and only late low-level signal in controls; the second primer set did not provide diagnostically useful separation. Overall, the work supports the potential of LAMP for rapid resistance screening, while highlighting that SNP genotyping demands stringent specificity and will require further primer refinement and validation prior to robust field implementation.
A abelha-melífera (Apis mellifera) é essencial para a agricultura e a biodiversidade através da polinização, mas as colónias estão cada vez mais ameaçadas por Varroa destructor, um ácaro ectoparasita que enfraquece os hospedeiros e transmite vírus, incluindo o Vírus das Asas Deformadas (Deformed Wing Virus, DWV). O controlo continua a depender fortemente de acaricidas, piretróides (fluvalinato, flumetrina), organofosforados (coumafos) e formamidinas (amitraz) , porém a utilização prolongada tem favorecido o desenvolvimento de resistência. Em V. destructor, a resistência aos piretróides está fortemente associada a mutações no gene do canal de sódio dependente de voltagem (VGSC), em particular às substituições M918L e L925V, amplamente reportadas na Europa e relevantes para a vigilância em Portugal. Este estudo teve como objetivo desenvolver um ensaio rápido baseado em LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) para deteção de mutações do VGSC associadas à resistência. Para estabelecer uma linha de base em Portugal, foi sequenciado o fragmento do VGSC (Domínio II) a partir de 100 ácaros recolhidos em 35 apiários. A genotipagem por sequenciação Sanger indicou que 38% das amostras analisadas com sucesso apresentavam o haplótipo resistente M918L/L925V, 54% eram do tipo selvagem e 8% permaneceram inconclusivas após repetição, evidenciando heterogeneidade geográfica. Com base em alinhamentos curados, foram desenhados dois conjuntos de primers LAMP direcionados à região de resistência (NEB LAMP Designer; LAMP DESIGNER v1.16), sujeitos a triagem in silico (critérios estruturais/termodinâmicos) e posteriormente otimizados por fluorescência em tempo real, com confirmação por eletroforese. Na otimização inicial (63–67 °C) observou-se amplificação tanto em amostras como em controlos sem molde (NTC), com perfis em “escada” no gel, compatíveis com amplificação independente de molde, provavelmente induzida por interações primer–primer e/ou estruturas secundárias. Em condições mais restritivas (68–70 °C), um dos conjuntos (NEB Set ID 36) apresentou discriminação parcial a 69 °C, com amplificação mais precoce em amostras resistentes do que em amostras selvagens e apenas sinal tardio de baixa intensidade nos NTCs, enquanto o segundo conjunto não revelou separação diagnóstica útil. Em conjunto, os resultados suportam o potencial do LAMP para rastreio rápido da resistência, mas evidenciam que a genotipagem de SNPs exige elevada especificidade, sendo necessária otimização adicional e validação antes de uma aplicação robusta em rotina e em campo.
A abelha-melífera (Apis mellifera) é essencial para a agricultura e a biodiversidade através da polinização, mas as colónias estão cada vez mais ameaçadas por Varroa destructor, um ácaro ectoparasita que enfraquece os hospedeiros e transmite vírus, incluindo o Vírus das Asas Deformadas (Deformed Wing Virus, DWV). O controlo continua a depender fortemente de acaricidas, piretróides (fluvalinato, flumetrina), organofosforados (coumafos) e formamidinas (amitraz) , porém a utilização prolongada tem favorecido o desenvolvimento de resistência. Em V. destructor, a resistência aos piretróides está fortemente associada a mutações no gene do canal de sódio dependente de voltagem (VGSC), em particular às substituições M918L e L925V, amplamente reportadas na Europa e relevantes para a vigilância em Portugal. Este estudo teve como objetivo desenvolver um ensaio rápido baseado em LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) para deteção de mutações do VGSC associadas à resistência. Para estabelecer uma linha de base em Portugal, foi sequenciado o fragmento do VGSC (Domínio II) a partir de 100 ácaros recolhidos em 35 apiários. A genotipagem por sequenciação Sanger indicou que 38% das amostras analisadas com sucesso apresentavam o haplótipo resistente M918L/L925V, 54% eram do tipo selvagem e 8% permaneceram inconclusivas após repetição, evidenciando heterogeneidade geográfica. Com base em alinhamentos curados, foram desenhados dois conjuntos de primers LAMP direcionados à região de resistência (NEB LAMP Designer; LAMP DESIGNER v1.16), sujeitos a triagem in silico (critérios estruturais/termodinâmicos) e posteriormente otimizados por fluorescência em tempo real, com confirmação por eletroforese. Na otimização inicial (63–67 °C) observou-se amplificação tanto em amostras como em controlos sem molde (NTC), com perfis em “escada” no gel, compatíveis com amplificação independente de molde, provavelmente induzida por interações primer–primer e/ou estruturas secundárias. Em condições mais restritivas (68–70 °C), um dos conjuntos (NEB Set ID 36) apresentou discriminação parcial a 69 °C, com amplificação mais precoce em amostras resistentes do que em amostras selvagens e apenas sinal tardio de baixa intensidade nos NTCs, enquanto o segundo conjunto não revelou separação diagnóstica útil. Em conjunto, os resultados suportam o potencial do LAMP para rastreio rápido da resistência, mas evidenciam que a genotipagem de SNPs exige elevada especificidade, sendo necessária otimização adicional e validação antes de uma aplicação robusta em rotina e em campo.
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Palavras-chave
Apis mellifera V. destructor