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Identification of Chestnut Hybrids Using SSR Markers and Bioinformatic Tools
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Authors
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Abstract(s)
Chestnut trees serve as a vital resource for food and timber production, yet invasive pests and diseases increasingly threaten their survival and productivity. In Europe, hybridization programs have been launched to develop resilient rootstocks, such as the ink disease-resistant CA90 hybrid (Castanea sativa × Castanea crenata), to combat pathogens like Phytophthora cinnamomi. However, distinguishing these hybrids from conventional varieties remains challenging, as current methods rely heavily on field observations and morphological traits. To address this gap, this study identified molecular markers using Simple Sequence Repeats (SSR) microsatellite markers and bioinformatics to differentiate CA90 hybrids from other chestnut varieties.
We analyzed 35 chestnut samples, including three CA90 controls, hybrids, and non-hybrid plants from Portugal, to establish genetic profiles based on SSR band patterns and motif variations. From 43 existing SSR markers, nine primers with null allelic features and low observed heterozygosity (Ho) were selected and modified for this study. Polymerase Chain Reaction (PCR) amplification and agarose gel electrophoresis were employed to visualize Deoxyribonucleic Acid. (DNA) bands, followed by Sanger sequencing of 27 amplified products to confirm genetic variations. This approach identified 31 SSRs across 22 sequences, with trinucleotide repeats dominating (67.74%), followed by dinucleotide (22.58%), mononucleotide (6.45%), and hexanucleotide (3.23%) motifs. Across the nine loci, 18 alleles were detected, ranging from one to three alleles per locus among the samples. Crucially, the CP4 locus emerged as a novel, hybrid-specific marker, exclusively present in CA90 samples, and should be combined with primer loci CP2, CP6, CP9, and CP10 during identification on gel for cost-effectiveness.
These SSR-based markers offer a reliable, cost-efficient solution to identify disease-resistant CA90 chestnut hybrids, surpassing traditional morphological methods. By enabling precise selection of resilient rootstocks, they enhance sustainable cultivation and pathogen management. These tools can optimize breeding programs, boost orchard productivity, and protect genetic diversity, proving essential for mitigating pest and disease threats while ensuring the long-term health of chestnut ecosystems.
Os castanheiros são um recurso vital para a produção alimentar e madeireira, mas a sua sobrevivência e produtividade são ameaçadas por pragas e doenças invasoras. Na Europa, foram inicializados programas de hibridização para desenvolver porta-enxertos resilientes, como o híbrido CA90 (Castanea sativa × Castanea crenata), resistente à doença da tinta (Phytophthora cinnamomi). Contudo, a distinção destes híbridos de variedades convencionais permanece um desafio, pois os métodos atuais dependem de observações de campo e características morfológicas. Para combater estas dificuldades, este estudo identificou marcadores moleculares usando marcadores microssatélites de repetições de sequência simples (SSR) e bioinformática para diferenciar o híbrido CA90 de outras variedades de castanheiro. Foram analisadas 35 amostras, incluindo três controlos CA90, híbridos e plantas não híbridas de Portugal, para estabelecer perfis genéticos baseados em padrões de bandas SSR e variações de motivos. De 43 marcadores SSR existentes, foram selecionados e modificados nove primers com alelos nulos e baixa heterozigosidade observada (Ho). Utilizou-se amplificação por PCR e eletroforese em gel de agarose para visualização das bandas de DNA, seguida de sequenciação de Sanger de 27 produtos amplificados para confirmar variações genéticas. Esta abordagem identificou 31 SSR em 22 sequências, com repetições trinucleotídicas a dominar (67,74%), seguidas de motivos dinucleotídicos (22,58%), mononucleotídicos (6,45%) e hexanucleotídicos (3,23%). Nos nove loci, detetaram-se 18 alelos, variando entre um a três alelos por locus. O locus CP4 destacou-se como um marcador exclusivo do CA90, devendo ser combinado com os loci CP2, CP6, CP9 e CP10 em análises de gel para maior custo-efetividade. Estes marcadores SSR oferecem uma solução fiável e económica para identificar híbridos CA90 resistentes a doenças, superando métodos morfológicos tradicionais. Ao permitir a seleção precisa de porta-enxertos resilientes, estes marcadores promovem o cultivo sustentável e o maneio de patógenos. Estas ferramentas podem otimizar programas de melhoramento, aumentar a produtividade de pomares e proteger a diversidade genética, sendo essenciais para mitigar ameaças de pragas e doenças, garantindo a saúde a longo prazo dos ecossistemas de castanheiro.
Os castanheiros são um recurso vital para a produção alimentar e madeireira, mas a sua sobrevivência e produtividade são ameaçadas por pragas e doenças invasoras. Na Europa, foram inicializados programas de hibridização para desenvolver porta-enxertos resilientes, como o híbrido CA90 (Castanea sativa × Castanea crenata), resistente à doença da tinta (Phytophthora cinnamomi). Contudo, a distinção destes híbridos de variedades convencionais permanece um desafio, pois os métodos atuais dependem de observações de campo e características morfológicas. Para combater estas dificuldades, este estudo identificou marcadores moleculares usando marcadores microssatélites de repetições de sequência simples (SSR) e bioinformática para diferenciar o híbrido CA90 de outras variedades de castanheiro. Foram analisadas 35 amostras, incluindo três controlos CA90, híbridos e plantas não híbridas de Portugal, para estabelecer perfis genéticos baseados em padrões de bandas SSR e variações de motivos. De 43 marcadores SSR existentes, foram selecionados e modificados nove primers com alelos nulos e baixa heterozigosidade observada (Ho). Utilizou-se amplificação por PCR e eletroforese em gel de agarose para visualização das bandas de DNA, seguida de sequenciação de Sanger de 27 produtos amplificados para confirmar variações genéticas. Esta abordagem identificou 31 SSR em 22 sequências, com repetições trinucleotídicas a dominar (67,74%), seguidas de motivos dinucleotídicos (22,58%), mononucleotídicos (6,45%) e hexanucleotídicos (3,23%). Nos nove loci, detetaram-se 18 alelos, variando entre um a três alelos por locus. O locus CP4 destacou-se como um marcador exclusivo do CA90, devendo ser combinado com os loci CP2, CP6, CP9 e CP10 em análises de gel para maior custo-efetividade. Estes marcadores SSR oferecem uma solução fiável e económica para identificar híbridos CA90 resistentes a doenças, superando métodos morfológicos tradicionais. Ao permitir a seleção precisa de porta-enxertos resilientes, estes marcadores promovem o cultivo sustentável e o maneio de patógenos. Estas ferramentas podem otimizar programas de melhoramento, aumentar a produtividade de pomares e proteger a diversidade genética, sendo essenciais para mitigar ameaças de pragas e doenças, garantindo a saúde a longo prazo dos ecossistemas de castanheiro.
Description
Keywords
Chestnut Castanea sativa Microsatellite markers (SSR) Hybrids CA90