Browsing by Author "Vaz, Madalena"
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- A bioinformática na identificação de genesPublication . Vaz, Madalena; Jorge, LurdesCom o objectivo de identificar genes, avaliaram-se nove EST (“Expressed Sequence Tag”) de uma biblioteca de cDNA de Trichoderma harzianum. Numa primeira etapa, as ESTs foram sequenciadas, sendo as sequências analisadas com programas bioinformáticos de análise de similaridade em bancos de dados, utilizando ferramentas como Blast P e Fasta X. Identificaram-se duas ESTs que se enquadravam nos objectivos, sendo uma delas a EST-1279, usada para a completa elucidação do gene lip2 de Trichoderma harzianum, cuja sequência pode ser acedida na base de dados com os códigos de acesso AM774154. O gene lip2 de Trichoderma harzianum sequenciado apresenta 1992 pb, sendo a sua ORF (“open reading frame”) constituída por 1215 nucleótidos. Estão sequenciados 550 pb da região do promotor e 229 pb do terminador.
- Caracterização de genes através de recursos bioinformáticosPublication . Jorge, Lurdes; Vaz, MadalenaApós descodificação da fase de leitura aberta de um gene, uma série de ferramentas bioinformáticas podem ser utilizadas para a caracterização da sequência deduzida da proteína. Uma pesquisa no website do Expasy Proteomics Server (http://expasy.org/tools) e uma sequência nucleotídica permitem-nos identificar e caracterizar proteínas, identificar motivos, padrões e perfis, inferir a sua estabilidade, localização celular ou função, fazer as predições das estruturas secundária e terciária, procurar sequências similares depositadas em bases de dados e compará-las, estabelecer relações filogenéticas. Neste caso usámos a ORF ("open reading frame") do gene lip2 de Trichoderma harzianum, cuja sequência pode ser acedida na base de dados da EMBL com o número de acesso AM774154.1. A proteína codificada por lip2 tem 404 aminoácidos, massa molecular calculada de 44604,3 Dalton e ponto isoeléctrico global calculado de 5,0. É considerada estável. Uma pesquisa efectuada na base integrada InterproScan incluiu lip2 na família das lipases com serina no centro activo (PROSITE PS00120, posição 210-219), e na das lipases_classe3 (Pfam PF01746, posição 131-190) com uma probabilidade de 1,4.e-31. http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/ A sua estrutura primária está de acordo com o consenso G-x-S-x-G, descrito como centro activo de lipases, inserido na sequência consenso de lipases com serina no centro activo: [LIV]-{KG}-[LIVFY]-[LIVMST]-G-[HYWV]-S-{YAG}-G-[GSTAC]. Os primeiros 25 aminoácidos constituem uma sequência sinal, que sugere a entrada desta proteína no retículo endoplasmático, e uma localização extracelular. No que respeita a modificações pós-traducionais, entre outras, a proteína codificada por lip2 apresenta três possíveis sítios de N-glicosilação, quatro sítios prováveis de N-miristoilação, um de palmitoilação e 28 sítios potenciais de fosforilação. A palmitoilação aumenta a superficie hidrofóbica e a afinidade para os substratos e desempenha um papel importante no transporte de proteína.
- Caracterização do gene LIP2 de Trichoderma harzianumPublication . Vaz, Madalena; Choupina, Altino; Jorge, LurdesOs fungos do género Trichoderma abrangem um grupo de fungos extremamente comuns em solos de todas as zonas climáticas. São eficientes produtores de enzimas com aplicações industriais, ou na natureza, estando envolvidos na degradação da parede celular dos fitopatogénios bem como na degradação de outros fungos, matéria orgânica e nutrientes secretados pelas raízes. As estirpes de Trichoderma produzem enzimas extracelulares e antibióticos com efeitos antifúngicos, sobretudo T. harzianum, T. virens e T. viride, sendo por isso usados como agentes de biocontrolo. De entre as enzimas de degradação das paredes celulares produzidas, encontram-se β-1,3 e β-1,6 glucanases, quitinases e proteases. Pensa-se que também as lipases poderão estar envolvidas na actividade enzimática de biocontrolo. Este trabalho teve como objectivo a caracterização do gene lip2 de Trichoderma harzianum, para isso recorreu-se a um conjunto de ferramentas de biologia molecular, bem como o recurso a programas bioinformáticos, de forma a efectuar a caracterização do gene, contribuindo assim para um melhor conhecimento deste. Procedeu-se à clonagem do gene lip2 num sistema de expressão, usando o vector pET-28a(+), e à avaliação da expressão da proteína lip2 por gel de SDS-PAGE em diferentes tempos de indução. Os resultados obtidos na clonagem indicaram uma banda total de 6584pb o que comprovou o sucesso da clonagem. A expressão da proteína após 8 horas de indução manifestou-se pela presença de uma banda de peso molecular estimado de 44kDa, observada por gel SDS-PAGE.T
- Characterization of a glucanase inhibitor protein from Phytophthora cinnamomi involved in plant responsesPublication . Martins, I.M.; Martins, Fátima; Belo, Hélio; Vaz, Madalena; Choupina, AltinoOomycetes from the genus Phytophthora are fungos-likeplant pathogens that are devastating fr agriculture and natural ecosystems. Due to their partucular physiological characteristics, no eficiente tratmentts, it against diseases caused by these microorganisms are presently available. To develop such treatments, it appears essential to dissect the molecular mechanisms that determine the interaction between Phytophthora speciesvand host plants.
- Characterization of molecular factors from plants pathogen Phytophthora cinnamomiPublication . Choupina, Altino; Martins, Fátima; Vaz, Madalena; Dominguez, Ángel; Martins, I.M.The culture of the chestnut tree is extremely important in the northern region of Portugal, occupying a significant proportion of useful agricultural area. The annual average chestnut production in Portugal can reach 20 000 tons. New plantation areas have increased in the last few decades. However the ink disease caused by the oomycete Phytophthora cinnamomi has damage and killed many trees and up to now no concrete solutions have been offered to control the illness. As a consequence, the disease propagation in the orchards of chestnut trees has been causing severe productivity and yield breaks. In addition to the economical losses, the importance of sociological and landscape aspects for the region cannot be neglected. Oomycetes species can manipulate biochemical and physiological processes in their host plants through a diverse array of virulence or avirulence molecules, known as effectors. In susceptible plants, these effectors promote infection by suppressing defense responses, enhancing susceptibility, or inducing disease symptoms. Alternatively, in resistant plants, effectors are recognized by the products of plant resistance genes, resulting in host cell death and effective defence responses known as the hypersensitive response (HR). We've identified and characterized some proteins involved in mechanisms of infection by Phytophthora cinnamomi: endo-1,3-beta-glucanase (complete cds), exo-glucanase (partial cds); glucanase inhibitor protein (GIP) (complete cds); necrosis-inducing Phytophthora protein 1 (NPP1) (complete cds) and transglutaminase. Several technologies, such reverse transcriptase PCR, in vivo expression technology, and Bioinformatics tools have been used to study the expression of selected genes from fungi during infection. In this work we intend to integrate the necessary bioinformatics tools that were used in this investigation. These tools include the use of Databases and associated homology programs as Fasta and Clustal, and several programs for sequence analysis and design of experiments such PCR. RT-PCR studies demonstrate that P. cinnamomi elicitins have higher expression in substrates such cellulose and sawdust. The studies of expression of these genes in vivo infection, with cell lines of Castanea sativa, reveal the intimate relationship between plants and phytopathogens has led to the coevolution of a number of complex strategies for attack and defense. For a pathogen to colonize a host successfully, it must develop mechanisms either to evade detection or, failing that, to subvert the defense responses.
- Cloning, characterization and in vitro and in planta expression of a glucanase inhibitor protein (GIP) of Phytophthora cinnamomiPublication . Martins, Ivone; Martins, Fátima; Belo, Hélio; Vaz, Madalena; Carvalho, Marisa; Cravador, Alfredo; Choupina, AltinoOomycetes from the genus Phytophthora are fungus-like plant pathogens that are devastating for agriculture and natural ecosystems. They are able to secrete a glucanase inhibitor protein (GIP) that inhibits the activity of endoglucanases (EGases) involved in defense responses against infection. One of the most widely distributed and aggressive Phytophthora species, with more than 1,000 host plants is P. cinnamomi. In this work we report the sequencing and characterization of a class of GIPs secreted by Phytophthora cinnamomi. The gip gene from P. cinnamomi has a 937 bp ORF encoding a putative peptide of 312 deduced amino acids. The expression of this gene was studied during growth in different carbon sources (glucose, cellulose and sawdust), by RT-qPCR and its level of expression was evaluated at five time points. The highest expression of gip gene occurred in sawdust at 8 h of induction. In vivo infection of C. sativa revealed an increase in gip expression from 12 to 24 h. At 36 h its expression decreased suggesting that a compensatory mechanism must occur in plant.
- Estudo numérico e experimental do campo de deformações na interface osso-implantePublication . Ribeiro, J.E.; Lopes, Hernani; Vaz, Madalena; Xavier, JoséAs ferramentas numéricas são actualmente utilizadas na simulação do comportamento mecânico de biomateriais. Para uma correcta análise é necessário o conhecimento das propriedades mecânicas destes materiais. As técnicas ópticas de medição de campo sem contacto estão bem adaptadas para a medição do comportamento global da estrutura. Os dados experimentais são utilizados na determinação das propriedades mecânicas e na validação das simulações numéricas. Neste trabalho pretende-se analisar o comportamento do tecido ósseo cortical de bovino na proximidade da interface com um implante metálico e sob a acção de diferentes carregamentos. O osso cortical é um material com uma estrutura altamente porosa, o que impede a medição rigorosa das deformações utilizando os métodos experimentais convencionais. Na análise desenvolvida utilizou-se a técnica da Correlação Digital de Imagem por permitir a medição do campo de deformações com elevada resolução na região de interface osso implante. Um modelo numérico da interface osso implante foi realizado com um código comercial de Elementos Finitos. A partir das propriedades mecânicas medidas, para as mesmas condições de carregamento e de fronteira determinaram-se os campos de deslocamento e deformação. A comparação destes resultados com os obtidos por via experimental permitiu validar as propriedades mecânicas determinadas a partir das medições experimentais.
- Isolation and analysis of lip2 gene from Trichoderma harzianumPublication . Vaz, Madalena; Belo, Hélio; Jorge, Lurdes; Gonzalez, Francisco J.; Monte, Enrique; Choupina, AltinoTrichodorma spp. covers a group of fungi extremely common in soils of all climatic areas. These fungi arc efficient enzyme producers, with industrial applications, or in nature, involved in the degradation of the coli wall of the phytopathogens as well as in the degradation of other fungi, organic matter and nutrients secreted by roots.
- Isolation and analysis of lip2 gene from Trichoderma harzianumPublication . Vaz, Madalena; Belo, Hélio; Jorge, Lurdes; Gonzalez, Francisco J.; Monte, Enrique; Choupina, AltinoThe genus Trichoderma is cosmopolitan in soils, wood decomposition and plant material. Species of Trichoderma are often dominant components of the soil microflora in various habitats. This is due to different metabolic capacity of the Trichoderma species and its aggressive competitiveness in nature. The genus Trichoderma are frequently used in biological control because of its antagonist ability of phytopathogenic fungi. The mechanisms employed by Trichoderma spp. to antagonize other fungi are competition (for space and / or nutrients), antibiosis and microparasites, while in the latter case, involved lytic enzymes such as proteases, glucanases, chitinases and lipases. Some of these proteins have a large agricultural potential, especially as active components of new formulations of fungicides. Trichoderma harzianum Rifai (Ascomycota, Hypocreales, Hypocreaceae) is a filamentous fungus, asexual, commonly isolated of tropical soil of plant material, rhizosphere ecosystems and decomposing organic material a ratio of 101-103 spores per gram of soil (Figure 1).
- Isolation and characterization of necrosis-inducing phytophthora protein 1 (npp1) gene from plants pathogen Phytophthora cinnamomiPublication . Martins, Ivone; Meirinho, Sofia G.; Belo, Hélio; Vaz, Madalena; Martins, Fátima; Choupina, AltinoOomycetes from the genus Phytophthora are fungus-like plant pathogens that are devastating for agriculture and natural ecosystems. Due to their particular physiological characteristics, no efficient treatments against diseases caused by these microorganisms are presently available. To develop such treatments, it appears essential to dissect the molecular mechanisms that determine the interaction between Phytophthora species and host plants. One of the most widely distributed Phytophthora specie, with nearly 1000 host species is Phytophthora cinnamomi. Associated with this pathogen is the ink disease of Castanea Sativa Mill being one of the most destructive diseases in C. Sativa in the northeast of Portugal and the most common symptoms are root necrosis and reduction in root growth, which invariably lead to the trees death. P. cinnamomi is able to secrete a novel class of necrosis-inducing proteins, known as Nep1-like proteins (NLPs), more specifically necrosis-inducing Phytophthora protein 1 (npp1), that causes necrosis on leaf and roots of the plant, leading to the plant death. In order to better evaluate the mechanism of plant necrosis induced by P. cinnamomi. The study of factors that affect npp1 gene expression is extremely important. The npp1 gene ORF comprises 770 bp encoding a 256 aa protein with a molecular weight of approximately 25 kD. In order to understand its function, gene expression in vitro in P. pastoris (heterologous expression), was studied during growth in different carbon sources, by RT-qPCR. Over expression of our gene in P. pastoris was also performed. In vivo expression technology has been used to study the expression of npp1 gene from fungi during infection by RT-PCR. In our work chestnut roots were infected with P. cinnamomi and mRNA was extracted at different times of infection to analyze gene expression. These and other results will be presented and discussed.