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- Virulência, enzimas lenhinolíticas e perfil metabólico de cryphonectria parasitica em estirpes virulentas e hipovirulentas convertidas por CHV1 hipovirusPublication . Abdellaziz, Omar; Jorge, Lurdes; Moura, Luísa; Coelho, Valentim; Gouveia, Maria EugéniaCryphonectria parasitica, fungo responsável pelo cancro do castanheiro, causa lesões necróticas (cancros corticais) no tronco e ramos das árvores hospedeiras. O hipovírus, Cryphonectria hypovirus 1 (CHV1) reduz a virulência (hipovirulência) e altera a morfologia do fungo em cultura (redução da pigmentação e esporulação). As estirpes hipovirulentas CHV1 são utilizadas com sucesso na Europa como agentes de controlo biológico do Cancro do castanheiro. Objetivos: O objetivo deste trabalho foi compreender o efeito do hipovírus na virulência e metabolismo do fungo, comparando a produção de algumas enzimas lenhinolíticas e os perfis metabólicos de estirpes virulentas e estirpes isogénicas de C. parasitica convertidas (com CHV1). Métodos: A virulência de cada isolado foi avaliada por inoculação de micélio do fungo em maçãs (cv. Golden Delicious) e em ramos destacados de castanheiro com um ano de crescimento. Para a deteção da atividade de enzimas lenhinolíticas (lacases, peroxidases e celulases) foram usados vários substratos e compostos indicadores. O perfil metabólico de C. parasitica foi avaliado pelo sistema Biolog FF microplates pela utilização de 95 fontes diferentes de carbono. Resultados: A utilização de MicroPlacas FF (Biolog, Inc.) indicaram que a utilização de 95 fontes de carbono pelos cinco isolados de C. parasitica, foram significativamente diferentes (p <0,001), quando os substratos foram agrupados em seis tipos de compostos químicos. Os maiores valores de AWCD foram obtidos para os hidratos de carbono, ácidos carboxílicos e polímeros, e os menores valores para os grupos aminas / amidas, aminoácidos e compostos diversos. Conclusões: A avaliação da virulência de isolados de C. parasitica é importante para o estudo dos processos de hipovirulência mediados pelo hipovírus CHV1. Os ramos destacados de castanheiro foram, em nosso estudo, mais adequados que o teste em maçã para diferenciar as estirpes hipovirulentas das virulentas de C. parasitica. Os isolados virulentos evidenciaram sempre uma maior atividade de lacase induzida por ácido tânico (Lac3) e de outras enzimas lenhinolíticas (LiP, MnP e celulase) quando comparadas com os hipovirulentos. Os resultados da análise dos perfis metabólicos mostram que alguns grupos de substratos foram mais consumidos por isolados hipovirulentos. Estes estudos abrem novas perspetivas para entender o processo biológico usado pelo hipovírus, e sugerem que este é um método para discriminar estirpes hipovirulentas, e estudar a ecologia e a aptidão em campo destes isolados do fungo.
- Epidemiologia do cancro do castanheiro. Dinâmica da distribuição espacial de Cryphonectria parasitica (Murrill) Barr.Publication . Gouveia, Maria Eugénia; Coelho, Valentim; Azevedo, JoãoO cancro do castanheiro, associado ao fungo Cryphonectria parasitica (Murrill) Barr., Ascomiceta da ordem Diaporthales, é uma doença com elevada agressividade em Castanea sativa. O fungo tem ainda capacidade de causar infecção em diferentes espécies de Quercus e outras espécies florestais de folha larga, embora com menor agressividade. Em Trás-os-Montes.a doença, referenciada em C. sativa desde 1989, caracteriza-se pela existência de elevado número de focos de maior ou menor extensão e com grau variável na incidência da doença. Para que as estratégias de luta baseadas na remoção dos cancros (erradicação) atinjam os resultados pretendidos, terão que se basear no conhecimento das características biológicas, epidemiológicas e da distribuição espaço–temporal da população parasita presente nos diferentes locais onde foi introduzida. Com este trabalho pretendeu-se conhecer as características da população patogénica, os mecanismos de multiplicação e dispersão do fungo e o efeito da remoção do inóculo no desenvolvimento da doença, aspectos que foram estudados durante três anos consecutivos, em 208 castanheiros de um souto em Parada-Bragança, um dos focos iniciais do aparecimento do cancro em Portugal. A dinâmica espacial do fungo foi analisada com base em métodos de distribuição espacial de dados pontuais, nomeadamente a função K de Ripley, uma análise de segunda ordem de ampla utilização em ecologia. A análise univariada K de Ripley foi aplicada para conhecer o padrão espacial das árvores infectadas em cada data inventariada, sendo a forma bivariada empregue no estudo da interacção espacial das infecções relativamente a árvores anteriormente infectadas no souto. Verificou-se que a distribuição das árvores infectadas no período de observação não era aleatória mas sim agregada. Verificou-se ainda existir uma associação positiva entre as árvores inicialmente infectadas e aquelas que viriam posteriormente e revelar sintomas da doença.
- Cancro do castanheiro: a luta cultural na redução do inóculo e manutenção sustentada dos soutosPublication . Gouveia, Maria Eugénia; Coelho, Valentim; Portela, EsterCryphonectria parasitica fungo Ascomiceta da ordem Diaphortales e família Valsaceae foi noticiado pela primeira vez em Portugal em 1989. Teve uma dispersão muito rápida em todas as regiões de castanheiro existindo focos com forte incidência da doença de maior ou menor dimensão em todos os locais onde foi introduzido. Este trabalho teve como objectivo avaliar a eficácia da extirpação dos cancros como meio de luta contra o cancro do castanheiro e estudar as características da população de C. parasitica. A extirpação dos cancros quando aplicada a sistemas de exploração de castanheiros para fruto revelou ser muito eficaz, necessitando no entanto de um acompanhamento continuado para ser eficiente. A população de C. parasitica evidenciou grande uniformidade nas características morfológicas relacionadas com a cor e crescimento dos isolamentos e maior variabilidade na produção de esporos, evidenciando ainda uniformidade em relação à sensibilidade ao cobre. Todos os isolamentos foram incluídos no mesmo grupo de compatibilidade vegetativa (VCG) e identificado como VCG 2-P o mais frequente na população de C. parasitica em Portugal.
- Characterization of chestnut bark fungal communities in healthy trees and blight recovered through natural or introduced hypovirulencePublication . Coelho, Valentim; Nunes, Luís; Moura, Luísa; Gouveia, Maria EugéniaVarious fungal species together with Cryphonectria parasitica (Murr.) Barr. have been isolated from chestnut tissues with blight symptoms. Microfungi remain in cankers during tissue healing, which occurs by transmitting hypovirulence by Cryphonectria hypovirus 1 (CHV1) compatible strains. However, studies focused on the diversity and ecology of the non-C. parasitica taxa on chestnut bark are lacking. This work evaluated the composition and richness of microfungi species associated with healthy chestnut trees, those with cankers healed by natural hypovirulence and those treated with hypovirulent strains (artificially introduced hypovirulence). Microfungi from diseased trees were isolated from six randomly selected points in the inner and external areas of the healed canker. In healthy trees, tissue samples were collected from 12 random locations on each tree’s trunk. Fungal species were identified based on morphological characteristics and ITS region sequencing using the universal primers ITS1 and ITS4. Four hundred thirty-one fungal isolates were obtained from which 38 operational taxonomic units (OTUs) were identified. The fungal communities varied from tree to tree and did not display similar patterns. The endophyte Biscogniauxia mediterranea and epiphyte Cytospora eucalypticola fungi were detected in all study locations and tree health conditions. Notably, C. parasitica (virulent and hypovirulent strains) was dominant in the inner area of healed cankers, accounting for 64.3% of the isolates, and the saprobe fungi Penicillium glabrum was dominant among non-C. parasitica microfungi species. Dissimilarity analyses showed low similarity between the microfungi communities found in the inner and external areas of the healed cankers. The study reveals the long-life span of C. parasitica in healed cankers and the therapeutic effect of natural and introduced hypovirulence.
- Comunidade de microfungos presente nos cancros tratados no tronco e ramos do castanheiro com a estirpe hipovirulenta (CHV-1)Publication . Coelho, Valentim; Guerra, Inês; Gouveia, Maria EugéniaMuitas espécies de fungos têm sido isoladas conjuntamente com Cryphonectria parasitica (Murr.) Barr dos tecidos de castanheiro com sintomas de Cancro do Castanheiro. Diferentes interações e comportamentos ecológicos foram identificados entre os diversos microfungos e C. parasitica. Foi objetivo deste trabalho (1) avaliar a composição de espécies de microfungos que co-ocorrem com C. parasitica após a introdução da estirpe hipovirulenta (2) estudar as interações dos diferentes microfungos com Cryphonectria Hypovirus I. Os fungos foram isolados de tecido vegetal de cancros curados retirados a 3 cm para o exterior e 3 cm para o interior e ainda no local da aplicação da estirpe CHV1. A identificação das diferentes espécies baseou-se em características morfológicas e métodos moleculares por amplificação e sequenciação da região ITS com a utilização dos iniciadores universais ITS1 e ITS4. Foram obtidos 75 isolados e identificadas 15 espécies. Os fungos presentes em maior número foram Biscogniauxia mediterranea, Penicillium glabrum e Cytospora diatrypelloidea. No exterior dos cancros curados as espécies presentes em maior número foram B. mediterranea e P. glabrum. C. diatrypelloidea foi a espécie mais representada no interior dos cancros curados
- Perfil de utilização de fontes de carbono de isolados Virulentos e Hipovirulentos de Chryphonecria parasiticaPublication . Moura, Luísa; Santos, Fernando; Martins, Rita; Coelho, Valentim; Gouveia, Maria EugéniaO fungo Cryphonectria parasitica responsável pela doença do cancro do castanheiro é muito agressivo, levando à morte das árvores hospedeiras. Cryphonectria hypovirus 1 (CHV1) infeta C. parasitica e reduz a virulência do fungo (hipovirulência) alterando a sua morfologia em meio de cultura (pigmentação e capacidade de esporulação). O controlo biológico por hipovirulência tem sido usado na Europa, desde os anos 80 e tem demonstrando bons resultados no tratamento da doença, assim como acontece também em Portugal. Variações genéticas e fenotípicas de isolados hipovirulentos podem afetar o seu desempenho no controlo do cancro do castanheiro, pelo que a seleção de isolados passa pela caraterização biológica, incluindo a sua capacidade de esporulação. A avaliação do perfil de utilização de fontes de carbono dos isolados hipovirulentos poderá contribuir para uma melhor compreensão do seu metabolismo, complementando assim a sua caracterização biológica. O perfil metabólico de isolados portugueses virulentos e hipovirulentos de C. parasitica, foi avaliado em microplacas Biolog FF. Culturas puras de cada isolado foram cultivadas em meio PDA a 25 °C na ausência de luz durante 7 dias. Os mesmos isolados foram expostos à luz do laboratório para indução da formação de esporos durante 5 dias. As estirpes hipovirulentas não formam esporos em condições de luz natural, pelo que foi induzida a sua produção. Os isolados hipovirulentos inoculados em placas de PDA (7 dias a 25º) foram colocadas numa câmara de cultura durante 15 dias a 25ºC, com fotoperíodo de 18 horas e 10.000 lux. Suspensões de micélio e de conídios induzidos pela luz a 10.000 lux foram utilizadas para inoculação de Microplacas Biolog FF e incubadas a 25ºC durante 7 dias na ausência de luz. A densidade óptica a 490 nm (atividade mitocondrial) foi determinada usando um leitor de microplacas Biolog e o equipamento ASYS UVM 340 (Hitech GmbH) para cada placa, em intervalos de 24 h durante 7 dias. Verificou-se que os hidratos de carbono, aminoácidos, aminas/amidos, polímeros e outros compostos foram mais consumidos pelos isolados hipovirulentos quando se utilizou suspensões de micélio obtido na ausência de luz, o que sugere uma adaptação ecológica e estabelecimento destes isolados (CHV1) após a sua introdução em castanheiros doentes no campo. Contrariamente, o perfil metabólico obtido a partir de esporos revelou maior atividade dos isolados virulentos na utilização dos compostos testados. Este estudo permitirá relacionar os perfis metabólicos obtidos a partir de micélio e de esporos das estirpes hipovirulentas com as suas características biológicas, em avaliação no âmbito do Projeto BioChestnut.
- Characterization of ligninolytic enzymes and metabolic profile of cryphonectria parasitica and the isogenic converted strains by CHV1 hypovirusPublication . Abdellaziz, Omar; Jorge, Lurdes; Moura, Luísa; Coelho, Valentim; Gouveia, Maria EugéniaCryphonectria parasitica, the causal agent of chestnut blight, causes necrotic lesions (so-called cankers) on the bark of stems and branches of susceptible host trees. Cryphonectria Hypovirus 1 (CHV1) infects C. parasitica and reduces the fungus virulence (hypovirulence) and alters the fungus morphology in culture (pigmentation and sporulation capacity). By this characteristics the mycovirus CHV1 is used in Europe as a biological control agent of Chestnut Blight.The aim of this project is to better understand the effect of the mycovirus on the fungi pathogenicity by comparing the production of some lignin degrading enzymes and the metabolic profiles of some virulent and hypovirulent (converted and original) strains. For qualitative evaluation, several different compounds have been used as indicators for ligninolytic enzymes production. For quantitative evaluation, among 9 strains 5 were chosen for biological tests and cultivation in minimal liquid media and the amount of enzyme produced were analysed. Virulent strains were found to cause more damage in chestnut branches and to produce more lignin degrading enzymes. In apple fruits, some CHV1 strains produced bigger rot lesions than wild type strains did. In parallel, Biolog FF MicroPlates have been used for the first time with Cryphonectria parasitica to assess their metabolic profiles by the utilization of 95 different carbon sources. Carbohydrates, amino acids, amines/amides, miscellaneous and polymers were found to be more consumed by hypovirulent strains; therefore, this may suggest. an adaptation in this fungal strains ecology and field fitness.
- Evaluation of virulence and the laccase production on Cryphonectria Parasitica virulent and converted strains by CHV1 HypovirusPublication . Boumnigel, Houssem; Coelho, Valentim; Souiai, Oucema; Jorge, Lurdes; Gouveia, Maria EugéniaBiological control by hypovirulence is an efficient method to control chestnut blight. The presence of Cryphonectria hypovirus 1 (CHV1) in Cryphonectria parasitica reduces its parasitic growth and sporulation capacity, female fertility, pigmentation, oxalate accumulation and laccase production. Indeed, laccases are involved in lignin degradation, and are also considered as a virulence determinant in C. parasitica. The aim of this work was to evaluate the laccase production in both virulent and converted strains and to access the virulence of these strains in vitro and on dormant chestnut stems. Five isolates were converted with two characterized hypovirulent C. parasitica isolates (RBB111, SR44.2). To evaluate the virulence of the isolates, dormant chestnut stems were inoculated with the virulent isolates, their converted ones and the hypovirulent isolates. The qualitative evaluation of laccase production was performed using Bavendamm test and RBBR test. For quantitative evaluation of laccase production strains were grown on PDB (Potato Dextrose Broth, 24g/L) and the sample readings taken by spectrophotometry using ABTS. The hypovirulent isolates used in this work has complete ability to convert virulent isolates. The infection area on chestnut stems caused by virulent strains was significantly higher (P<0.05) than the infection area caused by converted strains. The isolates Cast13 and Cast26 showed highest enzymatic activity. In the Bavendamm test, the highest dark area was observed for the converted strains Cast26/RBB111 and Cast17/RBB111 (15.04 mm2 ± 2.66 and 14.30 mm2 ± 1.02, respectively). For the quantitative assay two isolates were evaluated and showed a decrease of laccase especially the one converted with RBB111.
- Eficácia do tratamento do Cancro do Castanheiro em ensaios de inoculação com estirpes hipovirulentas de Cryphonectriaparasitica(CHV1) em Trás-os-Montes (Portugal)Publication . Pereira, Eric Carvalho; Araújo, Arsénio; Prospero, Simone; Coelho, Valentim; Rigling, Daniel; Gouveia, Maria EugéniaO castanheiro europeu (Castanea sativa Mill) é a principal espécie do sistema agroflorestal nas regiões montanhosas de Portugal. O castanheiro é atualmente afetado por vários agentes patogénicos agressivos, destacando-se o fungo Cryphonectria parasitica, que causa o Cancro do Castanheiro, que provoca a morte da árvore. A Hipovirulência, associada à presença de Cryphonectria hypovirus 1 no fungo fitoparasita, é um método específico e eficiente no controlo biológico do Cancro do Castanheiro. Para uma aplicação eficaz deste método no campo é necessário conhecer as características das estirpes agressivas de C. parasitica presentes no campo. Na Serra da Padrela foi selecionado um souto para realizar este estudo. Foi efetuado uma caracterização dos cancros ativos, e posteriormente o seu tratamento por Hipovirulência. Dos isolados obtidos dos cancros, 99% eram agressivos, sendo identificados 3 isolados como hipovirulentos. Todos foram classificados como vc-type EU-11, estando em maior abundância o mating-type 2, numa proporção de 2:1 comparativamente ao mating-type 1. Os cancros agressivos foram tratados com as estirpes hipovirulentas compatíveis tendo-se observado ao fim de 1 ano uma recuperação das árvores afetadas tendo-se confirmado a presença das estirpes hipovirulentas em cancro anteriormente agressivos.
- Spatial dynamics of chestnut blight disease at the plot level using the Ripley’s K functionPublication . Azevedo, João; Coelho, Valentim; Castro, João Paulo; Spínola, Diogo; Gouveia, Maria EugéniaWe used the Ripley’s K function, a second order analysis method, to describe the spatial dynamics of tree infection caused by chestnut blight (Cryphonectria parasitica (Murrill) Barr) in sweet chestnut orchards. Our research question was whether the location of infected trees affected the spatial pattern of spread of the disease in orchards. We also wanted to know whether existing patterns could be associated with management practices. Surveys of infections and mortality caused by chestnut blight were conducted at the tree level in 4 plots in 2003, 2004, 2005, and 2009 in the Curopos parish, Vinhais, Portugal. We applied the Ripley’s K function to locations of diseased (infected and dead) trees to look for spatial pattern. We compared locations from successive dates using the bivariate form of the K function to look for spatial association of diseased trees in consecutive years. We found both random and aggregated patterns of infected trees in the beginning of the study period and significant association of infected trees between successive dates, particularly at short distances. The results indicate that fast, short distance spread of chestnut blight occurs within orchards which can possibly be explained by both natural propagation of the disease and management practices.