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Título: Caracterização fenótipica e funcional de subpopulações de linfócitos T CD8+ em sangue periférico e líquido sinovial de doentes de artrite reumatóide e quantificação de citocinas e quimiocinas no soro desses doentes
Autor: Cardoso, Sandra Cristina Silva
Orientador: Carneiro, Maria Margarida Souto (Ori.)
Martins, Anabela (Ori.)
Alves, Maria José (Ori.)
Issue Date: 2011
Editora: Instituto Politécnico de Bragança, Escola Superior Agrária
Citação: Cardoso, Sandra Cristina Silva (2011) - Caracterização fenótipica e funcional de subpopulações de linfócitos T CD8+ em sangue periférico e líquido sinovial de doentes de artrite reumatóide e quantificação de citocinas e quimiocinas no soro desses doentes. Bragança: Escola Superior Agrária. Dissertação de Mestrado em Biotecnologia
Resumo: A Artrite Reumatóide (AR) é caracterizada por inflamação sistémica, sinovite e presença de auto-anticorpos (tal como o factor reumatóide -FR e proteínas citrulinadas). Esta patologia provoca lesões articulares, deficiências, diminuição da qualidade de vida, e doenças vasculares. Os Medicamentos Anti-reumáticos Modificadores da Doença, DMARD (Disease-Modifying Antirheumatic Drugs), tal como o Metotrexato (MTX) são agentes terapêuticos que podem reduzir os sintomas desta doença. Os linfócitos T CD8+, são células efectoras chave da resposta imune adquirida, contudo a sua actividade deve ser regulada de forma a permitir a eliminação eficiente dos patogénios e prevenir fenómenos de autoimunidade. De forma a compreender o papel os linfócitos T CD8+ na AR foram estudadas as alterações da frequência das suas subpopulações no Sangue Periférico (SP) e no Líquido Sinovial (LS) de doentes com essa patologia (com diferentes actividades da doença e presença ou ausência de terapia com MTX), assim como as citocinas intracelulares libertadas por essa subpopulação de células através da técnica de Citometria de Fluxo (CF). Foram igualmente estudadas as alterações dos níveis séricos de citocinas pró e anti-inflamatórias através de um imunoensaio baseado numa aplicação da CF baseada em microesferas, CBAs (Cytometric Bead Array). No nosso trabalho de investigação encontrámos alterações significativas das subpopulações de células T CD8+CD69+ (fenótipo de células activadas) nos doentes de AR. Concluímos que estas caracterizam a presença e o estado de actividade da doença, sendo um indicador directo da actividade da doença nos locais de inflamação. Desta forma consideramos que a análise da frequência desta subpopulação no SP dos doentes de AR permite confirmar um prognóstico da doença. Tendo em conta que a presença da subpopulação de células T CD8+ de Memória Efectora (com fenótipo CD27+CD62L-CCR7-) está correlacionada entre SP e LS de doentes de AR, podemos concluir que a partir de um screening feito no SP desses doentes obtenhamos informação sobre o comportamento dessa subpopulação celular no LS. A quantificação de citocinas e quimiocinas a partir do soro de doentes de AR veio, mais uma vez, demonstrar a importância destas nos mecanismos inflamatórios. Por um lado, proteínas com acção pró-inflamatória como a IL-10 e de recrutamento de células leucocitárias polimorfonucleares de fase aguda, como a MIP-1α estão diminuídas na AR. Por outro lado, quimiocinas como a MCP-1, MIP-1β, MIG e IL-8, que embora sejam sintetizadas por diferentes subpopulações têm o papel de recrutar células para o processo inflamatório e algumas também se encontram envolvidas na reparação de tecidos danificados, estão aumentadas nos doentes com a mesma patologia. Desta forma, concluímos que estas proteínas são importantes factores na manifestação e cronicidade desta patologia. A terapêutica por administração de MTX aos doentes de AR demonstrou causar alterações nas subpopulação de células T CD8+ de Memória Central (aumento significativo), de Memória Efectora (diminuição significativa) e nas subpopulações de células T CD8+ que libertam IL-17 (diminuição significativa). Estes resultados levam-nos a sugerir que um dos mecanismos de acção do MTX é feito sobre essas subpopulações de linfócitos T CD8+. Concluímos que várias subpopulações de linfócitos T CD8+ estudadas têm um impacto significativo no estabelecimento e permanência desta patologia crónica, o que estimulou interesse para desenvolver futuramente um possível diagnóstico para a AR a partir do conhecimento que produzimos relativamente ao papel dos linfócitos T citotóxicos (CTLs) nessa patologia, assim como uma nova terapêutica biológica direccionada para a acção desses linfócitos. Rheumatoid arthritis (RA) is characterized by systemic inflammation, synovitis and the presence of autoantibodies (such as citrullinated proteins and rheumatoid factor). This disease causes joint damage, disability, decreased quality of life, and vascular diseases. The Disease Modifying Anti-rheumatic Drug (DMARDs), such as Methotrexate (MTX), are therapeutic agents that can reduce the symptoms of this disease. The CD8+ T lymphocytes are key effectors cells of the acquired immune response, but their activity must be regulated in order to enable the efficient elimination of pathogens and prevent autoimmune phenomena. In order to understand the role of the CD8+ T cells in RA, we studied the changes in the frequencies of its subpopulations in the peripheral blood (PB) and synovial fluid (SF) of patients with RA (with different disease activity and with or without therapy with MTX), as well as intracellular cytokines released by this population of T cells using the technique of Flow Cytometry (FC). We also studied the changes in serum proinflammatory and anti-inflammatory cytokines by an immunoassay based on an application of the –FC based beads - Cytometric Bead Array (CBAs). In our research work we found significant changes in the CD8CD69+T cells subpopulation (phenotype of activated cells) in patients with RA. We thus conclude that these cells characterize the establishment and activity of RA, and can be assumed as a direct indicator of local inflammation. We thus consider that the analysis of the frequency of this subpopulation in the PB of patients affected with RA could be used as a new way of prognosis. Given that the frequency of the subpopulation of effector memory CD8+T cells (phenotype: CD27+CD62L-CCR7-) has shown a correlation in PB and SF of patients affected with RA, we can conclude that from a screening done in the PB of these patients, we obtain information about the behavior of these cells in the SF. Quantification of cytokines and chemokines from the serum of RA patients came once again demonstrate the importance of these inflammatory mechanisms. On the one hand proteins with proinflammatory action, such as IL-10, and recruitment of polymorphonuclear leukocyte cells of the acute phase, such as MIP-1α, are decreased in RA. On the other hand, chemokines such as MCP-1, MIP-1β, IL-8 and MIG, which although synthesized by different subpopulations have a role in recruiting cells to the inflammatory process and some are also involved in the repair of damaged tissues, are increased in patients with the same pathology. Thus, we conclude that these proteins are important factors in onset and chronicity of the condition. The therapy performed by administering MTX to patients with RA caused changes primarily on the subpopulation of Central Memory (significant increase) and Effector Memory (significant decrease) CD8+ T cells, but also on subset the CD8+T cells that release IL-17 (significant decrease). These results lead us to suggest that one mechanism of action of MTX is by targeting these subsets of CD8+ T cells. We conclude that the several subpopulations of CD8+ T cells that we studied have a significant impact on the establishment and maintenance of this chronic pathology. Therefore in the future we are interested in developing a possible diagnosis for RA based on the information we provided regarding the role of CD8+ Cytotoxic T Lymphocytes (CTLs) in this pathology, as well as a new biological therapies targeting these lymphocytes.
Arbitragem científica: yes
URI: http://hdl.handle.net/10198/6809
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