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Título: Obtenção de plantas de Humulus lupulus L. resistentes a vírus
Autor: Sousa, Maria João
Palavras-chave: Transformação genética
Humulus lupulus
Viroses
Agrobacterium
Bombardeamento de particulas
Regeneração
Issue Date: 2005
Editora: Faculdade de Ciências de Lisboa
Citação: Sousa, M. João (2005) - Obtenção de plantas de Humulus lupulus L. resistentes a vírus. Lisboa: Universidade de Lisboa. Tese de Doutoramento em Biotecnologia Vegetal
Resumo: A biotecnologia vegetal tornou-se uma ferramenta fundamental no melhoramento das mais variadas espécies. Na sua vertente de transformação genética, abriu novos horizontes de interesse agrícola e económico, no controlo de doenças e pragas. No lúpulo, a perda de produtividade, devido a infecções virais, levou a que a estratégia de transformação genética, para introdução de resistência a vírus, se tornasse extremamente interessante. Neste trabalho, procurou-se estabelecer condições para obter um sistema de transformação eficiente, com base na introdução do gene da cápside viral. Testou-se o sistema de regeneração em duas variedades (Eroica e Brewer’s Gold) e num clone espontâneo (Bragança). Utilizaram-se diferentes meios base e diferentes explantes (folhas, pecíolos e entrenós). Após determinação dos meios com maiores taxas de regeneração, testaram-se nestes, alterações de pH, adição de ácido salicílico e de sulfato de cobre, stresse térmico e diferentes concentrações de açúcar, conseguindo-se aumentar a frequência regenerativa, sem no entanto, o aumento ultrapassar os 10 %. Os entrenós foram os explantes com melhor resposta regenerativa (60 %). Após determinação molecular do sexo das plantas, seleccionou-se o clone Bragança para transformação genética, por ter taxas de regeneração superiores, encontrando-se ainda em boas condições fitossanitárias e fisiológicas. Este sistema de regeneração, permitiu desenvolver dois processos de transformação: 1) mediado por Agrobacterium e 2) bombardeamento de partículas. Nestes utilizaram-se dois plasmídios: o plasmídio p35SGUSINT contendo os genes uid A e npt II, para determinação das condições de transformação e, o plasmídio pROKArMV com os genes npt II e cpArMV (cápside viral). Os ensaios de transformação mediada por Agrobacterium foram optimizados, quanto ao tempo de corte antes da transformação, presença de acetoceringona, tempo de co-cultura, antibióticos para eliminação das bactérias, início da selecção e concentração do antibiótico de selecção. Verificaram-se os melhores resultados com corte dos explantes entre 26 e 48h antes da co-cultura, sem acetoceringona no meio, 48h de co-cultura, utilização da mistura 250 mg/L de carbenicilina e 250 mg/L de cefotaxima para eliminação bacteriana, início da selecção após 3 dias do início da co-cultura, com 25 mg/L de canamicina. No bombardeamento de partículas da optimização resultou: utilização da pressão a 1500 e 2000 psi, a uma distância de 9 cm. Plantas, com presença estável do gene cpArMV, determinada por análise de PCR (após 6 meses de selecção), foram testadas por Southern blotting, RT-PCR, DAS-ELISA e Northern blotting. Na transformação mediada por Agrobacterium e por bombardeamento de partículas, a percentagem obtida foi, respectivamente, 0,91 % e 0,76 %. Após 2 anos em terra, as plantas transformadas utilizando os dois processos, foram testadas para o gene da cpArMV. Destas, as obtidas por transformação mediada por Agrobacterium evidenciaram, pela técnica de Southern blotting, o gene cpArMV integrado no genoma. Plant biotechnology has become an essential tool for the improvement of plant cultivars. Genetic engineering, used as a strategy to control diseases and plagues in plants, has been an area of biotechnology with high agronomic and economic interest. In hop case, the lost of productivity, due to viral infections, as made the genetic engineering use to introduce virus resistance, highly worthwhile. In this study, the conditions were established to obtain an efficient transformation system based on the use of capsid viral gene. The regeneration system was tested in two varieties (Eroioca and Brewer’s.Gold) and in spontaneous clone (Bragança). Several basal mediums were used, as well as several types of explants (leaves, petiole and stems). The basal mediums with higher regeneration rates were selected and several other conditions were tested on these mediums: alterations on the pH, addition of salicylic acid and cupper sulphur, temperature stress and several sugar concentrations. Higher regeneration rates were achieved, but only up to 10%. Stems were the explants that exhibited the best regeneration frequency (60 %). After molecular identification of the sex of the plant, the clone Bragança was selected for genetic engineering, due to its superior regeneration rates, as well as its good phytosanitary and physiologic conditions. Using the established regeneration system, it was possible to develop two transformation processes: 1) Agrobacterium-mediated and 2) particle bombardment. Two plasmids were used in both processes: plasmid p35SGUSINT with uid A and npt II genes, for establishment of transformation conditions and, plasmid pROKArMV with npt II and cpArMV (viral capsid) genes. Agrobacterium-mediated transformation assays were optimised for: cutting time before transformation, presence of acetosseringone, period of co-culture, antibiotics used for bacteria elimination, beginning of selection, concentration of the selection antibiotic. Best results were obtained for, cutting of the explants between 26-48h before co-culture, without acetosseringone in the medium, 48h of co-culture, 250 mg/L of carbenicilin and 250 mg/L of cefotaxim for bacteria elimination, beginning of selection 3 days after the beginning of co-culture using 25 mg/L of kanamicin. Particle bombardment conditions optimisation resulted in the use of 1500 and 2000 psi pressure, at a distance of 9 cm. Transformed plant, showing stable presence of the cpArMV gene by PCR (after a selection period of 6 months), was tested by Southern blotting, RT-PCR, DAS-ELISA and Northern blotting. The percentage of transformation was 0.91% for the Agrobacterium-mediated process and 0.76% for particle bombardment. After two years in soil conditions, the plants originated from Agrobacterium-mediated and particle bombardment transformation, were tested for the cpArMV gene. From these, the plants obtained by Agrobacterium-mediated transformation, exhibited, through Southern analysis, the cpArMV gene integrated in the genome.
Arbitragem científica: yes
URI: http://hdl.handle.net/10198/6013
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