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Título: Análise de sulfonamidas no mel: validação e optimização de um método de HPLC-fluorescência
Autor: Correia, Daniela M.
Orientador: Dias, L.G.
Vilas-Boas, Miguel
Palavras-chave: Mel
Método de HPLC
Sulfonamidas
Métodos de detecção
Identificação das sulfonamidas
Método CHARM II
Issue Date: 2008
Editora: Instituto Politécnico de Bragança, Escola Superior Agrária
Citação: Correia, Daniela Matilde Marques - Análise de sulfonamidas no mel: validação e optimização de um método de HPLC-fluorescência. Bragança: Instituto Politécnico, Escola Superior Agrária, 2008. Dissertação de Mestrado em Qualidade e Segurança Alimentar
Resumo: Os antibióticos são usados no tratamento de abelhas com o intuito de combater infecções associadas às doenças da Loque Americana e Loque Europeia que atacam as larvas das abelhas levando à destruição da colmeia. As sulfonamidas são um dos grupos de antibióticos mais usados pelos apicultores. Como a Legislação Europeia, proíbe a comercialização do mel na presença de quaisquer resíduos de antibióticos, a implementação de métodos analíticos que permitam a detecção e quantificação destes resíduos afigura-se uma tarefa fundamental. O presente trabalho teve como objectivo a optimização, validação e aplicação de um método de HPLC, com detector de fluorescência e derivatização pré-coluna, para a análise de 11 sulfonamidas em amostras de mel: sulfatiazol, sulfamerazina, sulfametazina, sulfametizol, sulfametoxipiridazina, sulfisoxazol, sulfadoxina, sulfametoxazol, sulfadimetoxina, sulfaquinoxalina e sulfameter (padrão interno). O método de calibração usado foi o de sobreposição de matriz de mel com padrão interno. A separação foi efectuada numa coluna de fase reversa à temperatura de 32 ºC em modo de gradiente usando 2 eluentes preparados com diferentes proporções de tampão acetato (pH 4,0) e acetonitrilo. O tempo da corrida foi de 40 minutos. Os comprimentos de onda de excitação e de emissão usados foram 405 nm e 495 nm, respectivamente. A extracção de sulfonamidas das amostras de mel ou de soluções padrão de sulfonamidas com sobreposição de matriz de mel foi efectuada em SPE-C18, após um passo de hidrólise para quebra das ligações entre sulfonamidas e açúcares. Foram efectuadas calibrações usando soluções padrão de calibração de matriz de mel “claro” e de mel “escuro”, atendendo aos efeitos de matriz de mel obtidos nas sensibilidades das medições analíticas de algumas sulfonamidas. A linearidade do método para cada sulfonamida foi testada no intervalo de concentrações de 1-100 μg/L. Foi compensado o efeito de matriz pelo uso do método de sobreposição de matriz e da sulfonamida sulfameter como padrão interno. Os limites de detecção e quantificação para cada uma das sulfonamidas analisadas foram da ordem dos 0,4-3 μg/kg e 1-9 μg/kg de mel, respectivamente. O método de HPLC apresentou repetibilidade e precisão intermédia aceitáveis (CV em geral, inferiores a 5,0% e 15%, respectivamente). A exactidão do método foi aferida recorrendo a ensaios de recuperação, tendo-se obtido percentagens de recuperação entre 70-120%. Este método foi aplicado na detecção e quantificação de resíduos de antibióticos em amostras de mel após classificação da cor da amostra em mel “claro” ou mel “escuro”, e os resultados foram comparados com os obtidos pelo método qualitativo CHARM II (método aprovado pelo US-FDA para a análise de resíduos em mel).
The antibiotics are used in the treatment of bees to treat infections associated with American Foulbrood and European Foulbrood diseases, that attack the bees larvae taking to the destruction of the beehive. Sulfonamides are one of the groups of antibiotics widely used by the beekeepers. As the European Legislation, prohibit the commercialization of honey in the presence of any residues of antibiotics, the implementation of analytical methods that allow the detection and quantification of these residues is a fundamental task. The objective of this work was the optimization, validation and application of a HPLC method, with fluorescence detection and pre-column derivatisation, for the analysis of 11 sulfonamides in honey samples: sulfathiazole, sulfamerazine, sulfamethazine, sulfamethizole, sulfamethoxipyridazine, sulfisoxazole, sulfadoxine, sulfamethoxazole, sulfadimethoxine, sulfaquinoxalina and sulfameter (internal standard). The calibration method used was the sobreposition matrix method with internal standard. The separation was carried out in a reverse phase column at temperature of 32 ºC, with gradient using 2 eluents prepared with different proportions of buffer acetate solution (pH 4,0) and acetonitrile. The time of analysis was 40 minutes. The excitation and emission wavelengths were 405 nm and 495 nm, respectively. The sulfonamides extraction from honey samples or standard solution of sulfonamides prepared with honey sobreposition matrix, was performed with SPE-C18, after an hydrolysis step to liberate the sugar-sulfonamides bounds. Calibration were made using sulfonamide standard solutions either with “light” honey matrix and “dark” honey matrix, taking into account the honey matrix effects obtained in analytical measurement sensitivities for some sulfonamides. The linearity of the method for each sulfonamide was tested in the interval of concentrations from 1 to 100 μg/L. The matrix effect was compensated using of the sobreposition matrix method and sulfameter as internal standard. The detection and quantification limits for each analyzed sulfonamides were in the order of 0,4-3 μg/kg and 1-9 μg/kg of honey, respectively. The HPLC method presented acceptable repeatibility and intermediate precision (RSD%, in general, less than 5,0% and 15%, respectively). The method accuracy was checked with recovery assays and giving recovery percentages of 70-120%. This method was applied in the detection and quantification of antibiotics residues in honey samples after their colour classification, and the results were compared with the ones obtained by the qualitative method CHARM II (approved method for US-FDA for the analysis of residues in honey).
URI: http://hdl.handle.net/10198/1000
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