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O presente trabalho teve como principais objectivos o estudo do desenvolvimento de espécies de fungos ectomicorrízicos, nomeadamente Paxillus involutus e Pisolithus arhizus, na presença e ausência de simbionte – Pinus pinaster – bem como a avaliação das suas propriedades antioxidantes e de alguns compostos antioxidantes (tocoferóis e compostos fenólicos) em resposta à associação simbiótica.
Numa primeira fase do trabalho as espécies micorrízicas foram colocadas a crescer em meio de cultura sólido Melin-Norkans modificado, por um período de 45 dias, de forma a obter o micélio para análise de tocoferóis e actividade antioxidante e comparar os resultados obtidos com os resultantes da análise dos corpos de frutificação das mesmas espécies. Numa segunda fase, os fungos em estudo foram inoculados no mesmo meio de cultura, de forma análoga ao ensaio anterior, na ausência e na presença de simbionte – Pinus pinaster – de modo a avaliar as suas propriedades antioxidantes e concentração de compostos com igual actividade quando isolados e em associação. O mesmo estudo foi feito ao nível da planta. Por último, foi estudado o efeito do tempo de inoculação na actividade antioxidante, promovendo-se uma simbiose de 48 horas entre as espécies em estudo, Paxillus involutus, Pisolithus arhizus e Pinus pinaster.
A avaliação do crescimento em cultura dos fungos Paxillus involutus e Pisolithus arhizus, quer na presença quer na ausência de simbionte, foi realizada através da medição dos raios da cultura do micélio em placa de Petri.
As propriedades antioxidantes foram determinadas através da realização de ensaios de avaliação da actividade captadora de radicais livres 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo (DPPH), poder redutor e inibição da peroxidação lipídica.
O teor em compostos antioxidantes, nomeadamente tocoferóis, revelado pelas amostras foi determinado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) acoplada a um detector de fluorescência e a composição em compostos fenólicos foi determinada por HPLC acoplada a um detector de díodos (DAD).
As espécies de fungos ectomicorrízicos estudadas revelaram um crescimento inferior quando na presença de Pinus pinaster, sendo a espécie Pisolithus arhizus aquela que mais se adaptou a esta associação dado que revelou um desenvolvimento crescente ao longo do tempo, enquanto o fungo Paxillus involutus, revelou um decréscimo no seu crescimento ao fim de determinado tempo em associação.
Resumo
Crescimento e caracterização química de fungos micorrízicos e plantas de Pinus pinaster na presença e ausência do simbionte xiii
As espécies analisadas demonstraram ainda ser uma potencial fonte de importantes moléculas antioxidantes principalmente a espécie Pisolithus arhizus produzida in vitro que revelou uma elevada composição em γ-tocoferol (154,39 μg/g de massa seca). Relativamente ao perfil em compostos fenólicos, a espécie Paxillus involutus demonstrou ser a única fonte de ácido protocatéquico. As raízes de Pinus pinaster comprovaram também ser uma fonte de outros compostos fenólicos, nomeadamente ácido p-hidroxibenzóico e ácido p-cumárico, tanto isoladas como em simbiose com Paxillus involutus.
Quanto à actividade antioxidante foi detectada em todas as amostras avaliadas, sendo o carpóforo da espécie Pisolithus arhizus a que revelou propriedades superiores dada a sua concentração elevada de fenóis (297,94 mg EAG/g extracto) e valores de EC50 inferiores (< 0,60 mg/mL).
Ao longo do tempo registou-se uma diminuição geral no teor em fenóis e propriedades antioxidantes da planta, quando associada às espécies ectomicorrízicas em estudo, em especial com a espécie Pisolithus arhizus. Esta, reduz igualmente a actividade antioxidante na presença de Pinus pinaster, levando a crer que esta simbiose não parece ser indutora de stresse oxidativo. Já na espécie Paxillus involutus se verificam efeitos variáveis.
Os estudos realizados demonstram o potencial antioxidante das espécies analisadas, fornecendo nova informação acerca de potenciais fontes de compostos bioactivos a partir de fungos produzidos in vitro e reforçando o conhecimento já disponibilizado na preservação, melhoramento e salubridade dos habitats, e espécies que neles habitam, através de associações micorrízicas.
In the present work, the development of the ectomycorrhizal fungi, Paxillus involutus and Pisolithus arhizus, in the presence and absence of the symbiont – Pinus Pinaster – was evaluated, as well as their antioxidant properties, and tocopherols and phenolic compounds composition, in response to the symbiotic association. During the first part of the work, the mycorrhizal species were grown in modified Melin-Norkans medium during 45 days, in order to obtain enough mycelium for tocopherols and antioxidant activity analysis. These results were then compared with the ones obtained in fructification bodies of the same species. In the second part, the same procedure was used, but in presence and absence of the symbiont – Pinus pinaster – in order to determine the antioxidant potentialities in symbiotic synergy and isolated. The same analysis was carried out in the plant. Finally, the effect of inoculation time in antioxidant activity was evaluated after 48 hours of symbiosis between the studied species, Paxillus involutus, Pisolithus arhizus and Pinus pinaster. The evaluation of fungi growth, in presence and absence of the symbiont, was performed by measuring the micelia’s radius on a Petri dish. The antioxidant properties were determined by 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) free radicals scavenging activity, reducing power and lipid peroxidation inhibition assays. Tocopherols composition was determined by high performance liquid chromatography (HPLC) coupled to a fluorescence detector and phenolic compounds were evaluated by HPLC coupled to a diode detector (DAD). The mentioned ectomycorrhizal fungi revealed a reduced growth in the presence of Pinus pinaster; Pisolithus arhizus was the most adapted to this association, growing steadily, while Paxillus involutus slowed its growth after a while in association. The analyzed species, showed to be an important potencial source of antioxidant compounds, mostly Pisolithus arhizus that revealed the highest δ-tocopherol concentration (154.39 g/g of dried mass). Protocatechuic acid was found only in Paxillus involutus, while Pinus pinaster roots, both in association and isolated, showed to be a source of other phenolic compounds such us p-hydroxybenzoic and p-coumaric acids. Abstract Crescimento e caracterização química de fungos micorrízicos e plantas de Pinus pinaster na presença e ausência do simbionte xv All the analyzed samples revealed antioxidant activity, but Pisolithus arhizus fruiting bodies showed the higest phenolics concentration (297.94 mg EAG/g extract) and the lowest EC50 values (< 0.60 mg/mL). There was a general decrease, along the time, in phenolics content and antioxidant properties of the plant, when associated with the studied ectomycorrhizal species, in particular with Pisolithus arhizus. This species also reduces the antioxidant activity in the presence of Pinus pinaster, suggesting that this symbiosis does not seem to be inducer of oxidative stress. In Paxillus involutus variable effects were observed. The present work demonstrates the antioxidant potential of the analyzed species, adding new information regarding sources of new bioactive compounds with origin in fungi produced in vitro. This strengthens the knowledge on how to preserve and improve the salubrity of the habitats and their species, through mycorrhizal associations.
In the present work, the development of the ectomycorrhizal fungi, Paxillus involutus and Pisolithus arhizus, in the presence and absence of the symbiont – Pinus Pinaster – was evaluated, as well as their antioxidant properties, and tocopherols and phenolic compounds composition, in response to the symbiotic association. During the first part of the work, the mycorrhizal species were grown in modified Melin-Norkans medium during 45 days, in order to obtain enough mycelium for tocopherols and antioxidant activity analysis. These results were then compared with the ones obtained in fructification bodies of the same species. In the second part, the same procedure was used, but in presence and absence of the symbiont – Pinus pinaster – in order to determine the antioxidant potentialities in symbiotic synergy and isolated. The same analysis was carried out in the plant. Finally, the effect of inoculation time in antioxidant activity was evaluated after 48 hours of symbiosis between the studied species, Paxillus involutus, Pisolithus arhizus and Pinus pinaster. The evaluation of fungi growth, in presence and absence of the symbiont, was performed by measuring the micelia’s radius on a Petri dish. The antioxidant properties were determined by 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) free radicals scavenging activity, reducing power and lipid peroxidation inhibition assays. Tocopherols composition was determined by high performance liquid chromatography (HPLC) coupled to a fluorescence detector and phenolic compounds were evaluated by HPLC coupled to a diode detector (DAD). The mentioned ectomycorrhizal fungi revealed a reduced growth in the presence of Pinus pinaster; Pisolithus arhizus was the most adapted to this association, growing steadily, while Paxillus involutus slowed its growth after a while in association. The analyzed species, showed to be an important potencial source of antioxidant compounds, mostly Pisolithus arhizus that revealed the highest δ-tocopherol concentration (154.39 g/g of dried mass). Protocatechuic acid was found only in Paxillus involutus, while Pinus pinaster roots, both in association and isolated, showed to be a source of other phenolic compounds such us p-hydroxybenzoic and p-coumaric acids. Abstract Crescimento e caracterização química de fungos micorrízicos e plantas de Pinus pinaster na presença e ausência do simbionte xv All the analyzed samples revealed antioxidant activity, but Pisolithus arhizus fruiting bodies showed the higest phenolics concentration (297.94 mg EAG/g extract) and the lowest EC50 values (< 0.60 mg/mL). There was a general decrease, along the time, in phenolics content and antioxidant properties of the plant, when associated with the studied ectomycorrhizal species, in particular with Pisolithus arhizus. This species also reduces the antioxidant activity in the presence of Pinus pinaster, suggesting that this symbiosis does not seem to be inducer of oxidative stress. In Paxillus involutus variable effects were observed. The present work demonstrates the antioxidant potential of the analyzed species, adding new information regarding sources of new bioactive compounds with origin in fungi produced in vitro. This strengthens the knowledge on how to preserve and improve the salubrity of the habitats and their species, through mycorrhizal associations.
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Citation
Reis, Filipa Sofia Dinis (2010). Crescimento e caracterização química de fungos micorrízicos e plantas de Pinus pinaster na presença e ausência do simbionte. Bragança: ESA. Dissertação de Mestrado em Biotecnologia
Publisher
Instituto Politécnico de Bragança, Escola Superior Agraria