| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
| 3.11 MB | Adobe PDF |
Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
Um total de 49 isolados de Phytophthora spp. associados com a doença da tinta do
castanheiro foram obtidos, pelos métodos clássicos de isolamento, em diferentes situações de
crescimento do castanheiro na região Norte de Portugal: viveiros, plantações jovens, soutos
adultos e do solo. Os isolados de Phytophthora foram identificados por PCR-RFLP da região
ITS-rDNA amplificada pelos “primers” universais ITS6 (Cooke & Duncan, 1997) e ITS4
(White et al., 1990). A restrição enzimática do fragmento amplificado foi realizada com as
enzimas Alu I, Msp I e Taq I cujo perfil de restrição permite a identificação ao nível da espécie
no género Phytophthora. A população de Phytophthora associada com a doença da tinta foi
caracterizada quanto ao tipo de compatibilidade sexual, polimorfismo RAPD e sensibilidade
ao metalaxil.
P. cinnamomi é a espécie predominante em viveiro, plantações jovens, soutos adultos e
no solo junto das plantas mortas. Apenas quatro isolados foram identificados como P.
cambivora e dois deles foram obtidos em plantas de castanheiro com sintomas característicos
da doença no colo da planta. Todos os isolados (P. cambivora e P. cinnamomi) são A2 e 9 %
dos isolados de P. cinnamomi evidenciaram sensibilidade reduzida ao metalaxil. A
caracterização RAPD permitiu a separação das espécies de Phytophthora associadas à doença
da tinta embora os primers “10-mer” utilizados não tivessem possibilitado a caracterização dos
isolados de P. cinnamomi. O estudo RAPD permitiu, no entanto, identificar um fragmento de
amplificação característico de P. cinnamomi. O fragmento foi purificado clonado e
sequenciado (SCAR) e desenharam-se primers específicos (Cin1, Cin2 e Cin3) para a detecção
e identificação de P. cinnamomi por PCR. Os primers utilizados na combinação Cin2/Cin1 e
Cin3/Cin1 proporcionam um produto de amplificação PCR com aproximadamente 650 pb.
Com esta metodologia de diagnóstico não se detectaram reacções cruzadas com as espécies de
P. cactorum, P. capsici, P. cinnamomi var. parvispora, P. citricola, P. cryptogea,
P. nicotianae, P. quercina, P. syringae e ainda com Cryphonectria parasitica, Pythium sp. e
Castanea sativa. O método PCR-Diagnóstico foi aplicado com sucesso, em raízes de
castanheiro, que cresceram em substrato inoculado com P. cinnamomi, em tecidos vegetais
(folhas de castanheiro) e na água da técnica armadilha de detecção de Phytophthora no solo. A total of 49 isolates of Phytophthora spp. associated with ink disease of chestnut were
obtained by classical methods from diverse chestnut growing regions of the north of Portugal:
nurseries, young and old chestnut groves, and also in the soil near dead plants of sweet
chestnuts. Phytophthora isolates were identified by PCR-RFLP of ITS-rDNA amplified by the
universal primer pair ITS6 (Cooke & Duncan, 1997) and ITS4 (White et al., 1990). Restriction
digestions of the amplified DNA product were performed with restriction enzymes Alu I,
Msp I, and Taq I, which allowed individual species identification. The population of
Phytophthora was characterised in terms of mating type, metalaxil resistance and RAPD
polymorphisms.
P. cinnamomi is the most prevalent species in nurseries, orchards and in soil of chestnut
groves. Only four isolates were identified as P. cambivora and two of them were obtained
from typical rot crown of chestnut. All the isolates (P. cambivora and P. cinnamomi) were
mating type A2 and 9 % of P. cinnamomi were metalaxil tolerant. Although RAPD
polymorphisms allowed species differentiation the “10-mer” primers used were not suitable
for P. cinnamomi characterization. The RAPD analyses allowed, however, the identification of
a fragment characteristic of P. cinnamomi. The fragment was purified, cloned and sequenced
(SCAR) and then species-specific primers were designed (Cin1, Cin2, and Cin3) for detection
and identification of P. cinnamomi by PCR. Each primer pairs Cin2/Cin1 and Cin3/Cin1
produced an amplicon of approximately 650 bp from all tested P. cinnamomi isolates. Both
primer pairs revealed no undesirable cross-reaction with a diverse range of Phytophthora
species (P. cactorum, P. capsici, P. cinnamomi var parvispora, P. citricola, P. cryptogea,
P. nicotianae, P. quercina, P. syringae), Cryphonectria parasitica, Pythium sp., and Castanea
sativa. The PCR-Diagnostic assay based on the species-specific primers was successfully used
to detect P. cinnamomi in roots of chestnut plants, which were grown in artificially infected
substrate with this pathogen, in bait tissue (chestnut leaves) and in the water of the same bait
test.
Description
Keywords
Doença da tinta do castanheiro Phytophthora cinnamomi Phytophthora cambivora PCR diagnóstico
Citation
Gouveia, Eugénia (2004). Métodos moleculares na identificação caracterização e detecção de Phytophthora cambivora (Petri) Buisman e Phytophthora cinnamomi Rands associadas com a doença da tinta do castanheiro. Vila Real: UTAD. Tese de Doutoramento em Ciências Agronómicas - Protecção de Plantas