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Abstract(s)
Silk is a natural protein fibre spun by spiders, some insects and silkworms. Spider silk is of interest because of its mechanical strength, elasticity and biocompatibility, in fact, spider silk is considered to be the strongest natural biopolymer known. Recombinant production of spider silk proteins has begun to meet the needs of the growing biotechnological interests, and recombinant production in various hosts has been a widely used approach, with varying results. In search of mimicking the silk proteins, 4RepCT has been engineered with only 4 gly/ala repeats followed by a non-repetitive C-terminal. This protein has been successfully produced in a soluble form using Escherichia coli, yet forming macroscopic silk-like fibres. Studies on 4RepCT fibres have shown biocompatibility and a limited immunological response when subcutaneously implanted in rats.
Functionalization is a process where additional peptide motifs, protein domains or organic compounds are coupled to 4RepCT to add new properties for use in medical and biotechnology disciplines. There is, however, currently, a need for new coupling methods, in addition to, for example, manipulation on the genetic level. Therefore, this study was aimed to investigate a new method for functionalization of 4RepCT silk using two model proteins (domain Z and fibroblast growth factor-2) with the help of Sortase A mediated covalent coupling. The results have shown that a Sortase A enzyme with 3 mutations, coupling at ambient temperature and a reaction time between 0.5 and 1.5 h are suitable conditions for efficient coupling of the model proteins to 4RepCT silk coatings. Coupling of the Z domain to silk using the Coupling during coating (CDC) method and FGF2 to silk using the Coupling after coating (CAC) method showed best binding of their target molecules (IgG and FGF2 receptor, respectively). Analysis by Surface Plasmon Resonance was efficient to distinguish these differences in binding rates.
A seda é uma fibra proteica de origem natural produzida por aranhas e alguns insectos, como, por exemplo, o bicho - da - seda. A seda produzida pelas aranhas reveste-se de particular interesse devido à sua resistência mecânica, elasticidade e biocompatibilidade. De facto, a seda produzida pelas aranhas é considerada como sendo o polímero mais resistente que existe. A produção recombinante de proteínas da seda de aranha iniciou-se como objectivo de satisfazer as necessidades crescentes da industria biotecnológica, e tem sido produzida em vários hospedeiros com resultados variáveis. Na demanda de imitar as proteínas da seda, 4RepCT foi modificada de forma a conter apenas 4 repetições gly/ala, seguidas por um C terminal não repetitivo. Esta proteína recombinante foi produzida com sucesso, na forma solúvel, em Escherichia coli, gerando, porém, fibras macroscópicas semelhantes à seda. Estudos em fibras 4 RepCT mostraram a existência de biocompatibilidade e uma resposta imunológica limitada quando implantadas subcutaneamente em ratos. A funcionalização é um processo em que péptidos adicionais, proteínas ou compostos orgânicos são acoplados á 4RepCT para adicionar novas propriedades a estes polímeros para que possam ser utilizados nas áreas médicas e biotecnológicas. No entanto, actualmente existe a necessidade de desenvolver novos métodos de acoplamento associados, por exemplo, a técnicas de manipulação genética. Assim, este estudo visou a investigação de um novo método de funcionalização da seda 4RepCT , utilizando como modelo duas proteínas (domínio Z e factor 2 de crescimento de fibroblastos) com o auxílio do acoplamento covalente mediado pela sortase A. Os resultados obtidos demostraram que a temperatura ambiente um tempo de reacção entre 0,5 e 1.5 h são as condições adequadas para o acoplamento eficiente da sortase A com 3 mutações . Tanto o acoplamento do domínio Z á proteína da seda durante o método de revestimento (CDC) como o acoplamento doFGF2 á proteína da seda após o método de revestimento (CAC) apresentou melhor ligação ás suas moléculas alvo (IgG e receptor de FGF2, respectivamente).A análise de ressonância de plasma de superfície, foi eficiente para distinguir essas diferenças nas taxas de ligação.
A seda é uma fibra proteica de origem natural produzida por aranhas e alguns insectos, como, por exemplo, o bicho - da - seda. A seda produzida pelas aranhas reveste-se de particular interesse devido à sua resistência mecânica, elasticidade e biocompatibilidade. De facto, a seda produzida pelas aranhas é considerada como sendo o polímero mais resistente que existe. A produção recombinante de proteínas da seda de aranha iniciou-se como objectivo de satisfazer as necessidades crescentes da industria biotecnológica, e tem sido produzida em vários hospedeiros com resultados variáveis. Na demanda de imitar as proteínas da seda, 4RepCT foi modificada de forma a conter apenas 4 repetições gly/ala, seguidas por um C terminal não repetitivo. Esta proteína recombinante foi produzida com sucesso, na forma solúvel, em Escherichia coli, gerando, porém, fibras macroscópicas semelhantes à seda. Estudos em fibras 4 RepCT mostraram a existência de biocompatibilidade e uma resposta imunológica limitada quando implantadas subcutaneamente em ratos. A funcionalização é um processo em que péptidos adicionais, proteínas ou compostos orgânicos são acoplados á 4RepCT para adicionar novas propriedades a estes polímeros para que possam ser utilizados nas áreas médicas e biotecnológicas. No entanto, actualmente existe a necessidade de desenvolver novos métodos de acoplamento associados, por exemplo, a técnicas de manipulação genética. Assim, este estudo visou a investigação de um novo método de funcionalização da seda 4RepCT , utilizando como modelo duas proteínas (domínio Z e factor 2 de crescimento de fibroblastos) com o auxílio do acoplamento covalente mediado pela sortase A. Os resultados obtidos demostraram que a temperatura ambiente um tempo de reacção entre 0,5 e 1.5 h são as condições adequadas para o acoplamento eficiente da sortase A com 3 mutações . Tanto o acoplamento do domínio Z á proteína da seda durante o método de revestimento (CDC) como o acoplamento doFGF2 á proteína da seda após o método de revestimento (CAC) apresentou melhor ligação ás suas moléculas alvo (IgG e receptor de FGF2, respectivamente).A análise de ressonância de plasma de superfície, foi eficiente para distinguir essas diferenças nas taxas de ligação.
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Keywords
Seda Acoplamento enzimático